Slit2-Robo1信號通路在早期糖尿病腎病腎小球血管新生中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　異常血管新生是糖尿病腎病和糖尿病視網(wǎng)膜病變的典型的病理現(xiàn)象，其發(fā)生機(jī)制至今尚不完全清楚。既往已經(jīng)證實(shí)過表達(dá)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是早期糖尿病腎病和視網(wǎng)膜異常血管新生的重要驅(qū)動因素。VEGF能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增生、遷移和成管，并增加血管的通透性。阻止VEGF的分泌和活性增加能有效減輕腎小球肥大、減輕腎小球基底膜的增厚以及減少尿蛋白的排泄，但臨床研究證實(shí)VEGF單抗治療糖尿病會引起許多不良反應(yīng)，如腎血栓性微血管病、血壓

2、增高和蛋白尿增多。因此，需要繼續(xù)研究糖尿病血管新生的發(fā)病機(jī)制并找到有效的治療靶點(diǎn)和治療策略。
　　分泌型糖蛋白Slit2及其受體Robo最初作為一類重要的神經(jīng)元軸突導(dǎo)向因子被發(fā)現(xiàn)。隨著對Slit-Robo信號通路作用機(jī)制研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)該信號通路還參與血管新生（包括腫瘤）、炎癥、白細(xì)胞趨化及血管滲漏等過程。如在腫瘤、子宮內(nèi)膜異位和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)滑膜炎的血管生成中起著促進(jìn)的作用。尤其有研究報道Slit2/Robo1信號通路參與了糖

3、尿病視網(wǎng)膜病變的病理血管生成，但該這信號通路是否參與糖尿病腎病腎小球病理性血管生成未見文獻(xiàn)報道。
　　本課題首先觀察早期糖尿病腎病Slit2-Robo1信號通路的表達(dá)，探討該通路蛋白與血管新生和蛋白尿等指標(biāo)的相關(guān)性;接下來在體外建立模擬體內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞生長環(huán)境，構(gòu)建不含Slit2的高糖系膜細(xì)胞條件培養(yǎng)基（目的是去除系膜細(xì)胞源性Slit2對內(nèi)皮細(xì)胞Slit2/Robo1信號通路的影響），將該條件培養(yǎng)基作用于培養(yǎng)人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞，觀察該高

4、糖條件培養(yǎng)基能否激活腎小球內(nèi)皮細(xì)胞中的Slit2/Robo1信號通路，而且該通路激活后是否促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和成管等血管新生活動。旨在闡明Slit2-Robo1信號通路在糖尿病腎小球內(nèi)皮血管新生的作用機(jī)制，為糖尿病腎病病理性血管新生的防治尋找新的方向。
　　方法：
　　我們的實(shí)驗(yàn)包括組織實(shí)驗(yàn)研究和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究兩部分。
　　第一部分：Slit2/Robo1信號通路蛋白在早期糖尿病腎病腎小球中的表達(dá)及意義。

5、>　　1.收集病理符合Tervaert's糖尿病腎病病理分型Ⅰ-Ⅱa期，且患者24h尿蛋白大于30mg小于500mg，eGFR大于90mL/min/1.73m2等早期糖尿病腎病納入標(biāo)準(zhǔn)的19例Ⅱ型糖尿病DN標(biāo)本，對照組為正常的癌旁腎組織病人(n=15)。
　　2.免疫組化染色Slit2、Robo1和CD31在糖尿病腎病腎小球中的表達(dá)變化。
　　3.相關(guān)性分析Slit2/Robo1信號通路蛋白和CD31蛋白、24h蛋白尿等臨床

6、指標(biāo)的關(guān)系。
　　第二部分：高糖系膜細(xì)胞條件培養(yǎng)基對腎小球內(nèi)皮細(xì)胞Slit2-Robo1信號通路的影響及其與血管新生的關(guān)系。
　　1.高糖對培養(yǎng)人系膜細(xì)胞Slit2分泌的影響。細(xì)胞分別用5.5mM葡萄糖DMEM培養(yǎng)基、33mM葡萄糖DMEM培養(yǎng)基、33mM葡萄糖+Slit2siRNA DMEM培養(yǎng)基和5.5mM葡萄糖+Slit2siRNA DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48h。免疫印跡、定量實(shí)時PCR和酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢查Sl

7、it2在人腎小球系膜細(xì)胞中的表達(dá)。
　　2.制備人腎小球系膜細(xì)胞條件培養(yǎng)基：人腎小球系膜細(xì)胞培養(yǎng)于33mM葡萄糖+Slit2siRNA DMEM培養(yǎng)基或5.5mM葡萄糖+Slit2siRNA DMEM培養(yǎng)基。48小時后，收集該培養(yǎng)基，與內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基按體積1∶1混合構(gòu)建為人腎小球系膜細(xì)胞條件培養(yǎng)基（糖濃度通過添加葡萄糖維持以前的濃度）。
　　3.高糖系膜細(xì)胞條件培養(yǎng)基對內(nèi)皮細(xì)胞Slit2-Robo1信號通路分子表達(dá)的時間

8、依賴性實(shí)驗(yàn)。免疫印跡和定量實(shí)時PCR檢測Slit2/Robo1、PI3K/Akt和HIF-1α/VEGF信號通路蛋白在33mM高糖系膜細(xì)胞條件培養(yǎng)基作用0、6、12、24和48h后的表達(dá)變化，旨在篩選出最佳時間點(diǎn)作為下步阻斷實(shí)驗(yàn)。
　　4.Robo1基因沉默后對內(nèi)皮細(xì)胞PI3K/Akt和HIF-1α/VEGF信號通路蛋白的影響。內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)于33mM組、33mM+Control siRNA組和33mM+Robo1siRNA組24h

9、，再用免疫印跡和定量實(shí)時PCR檢測各蛋白的表達(dá)。
　　5.PI3K抑制劑對HIF-1α/VEGF信號通路蛋白的影響。內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)于33mM組和33mM+LY294002（PI3K抑制劑）組24h，再用免疫印跡和定量實(shí)時PCR檢測各蛋白的表達(dá)。
　　6.分別用細(xì)胞流式、CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)、劃痕愈合試驗(yàn)、Transwell遷移試驗(yàn)和內(nèi)皮細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)檢測在高糖系膜細(xì)胞條件培養(yǎng)基作用(24h)下Robo1基因沉默和PI3K抑制對內(nèi)皮

10、細(xì)胞增殖、遷移和成管的影響。
　　結(jié)果：
　　第一部分：
　　1.腎小球血管內(nèi)皮細(xì)胞均可見Slit2和Robo1表達(dá);
　　2.與正常腎組織相比，早期DN腎小球Slit2/Robo1組化染色強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，提示早期DN腎小球Slit2/Robo1信號途徑被活化。
　　3.Slit2和Robo1蛋白的表達(dá)量分別與CD31蛋白表達(dá)量成正相關(guān)，也與早期DN的24h尿蛋白成正相關(guān)，提示Slit2/Robo1信號途徑可

11、能參與了早期DN腎小球中的病理性血管生成，啟動微白蛋白尿的發(fā)生。
　　第二部分：
　　1.高糖可刺激系膜細(xì)胞大量分泌Slit2蛋白，該高表達(dá)的slit2可能是系膜細(xì)胞幫助腎小球內(nèi)皮血管新生的主要原因之一;
　　2.高糖系膜細(xì)胞條件培養(yǎng)基能活化腎小球內(nèi)皮細(xì)胞中的Slit2/Robo1、PI3K/Akt和HIF-1α/VEGF信號通路，該作用呈時間依賴性。
　　3.阻斷Robo1能抑制PI3K/Akt和HIF-1α/

12、VEGF信號通路的激活;抑制PI3K能壓制HIF-1α/VEGF信號通路激活。
　　4.高糖系膜細(xì)胞條件培養(yǎng)基能促進(jìn)人腎小球細(xì)胞的增殖、遷移和成管。阻斷Robo1和抑制PI3K均能抑制能高糖系膜細(xì)胞條件培養(yǎng)基的促血管生成作用。
　　結(jié)論：
　　1.Slit2/Robo1信號途徑可能參與了早期DN腎小球中的病理性血管新生，與微量白蛋白尿的發(fā)生有關(guān);
　　2.高糖可刺激系膜細(xì)胞大量分泌Slit2蛋白，該高表達(dá)的Sli

13、t2可能是系膜細(xì)胞幫助腎小球內(nèi)皮細(xì)胞血管新生的主要原因之一;
　　3.高糖系膜細(xì)胞條件培養(yǎng)基能活化腎小球內(nèi)皮細(xì)胞中的Slit2/Robo1、PI3K/Akt和HIF-1α/VEGF信號通路，該作用呈時間依賴性;
　　4.高糖系膜細(xì)胞條件培養(yǎng)基能促進(jìn)人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和成管;阻斷Robo1和抑制PI3K均能抑制高糖系膜細(xì)胞條件培養(yǎng)基的促內(nèi)皮細(xì)胞血管生成作用。這些結(jié)果提示Slit2/Robo1信號通路可能成為干擾和治療