mTOR信號(hào)通路在糖尿病腎病大鼠足細(xì)胞損傷中的研究.pdf

1、目的：
　　通過阻斷哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin mTOR）信號(hào)通路對(duì)糖尿病腎病（diabetic nephropathy DN）大鼠足細(xì)胞Ezrin、α-SMA蛋白及外周血Th17/Treg細(xì)胞的研究，探討mTOR通路對(duì)DN足細(xì)胞骨架蛋白和肌動(dòng)蛋白合成的影響及Th17/Treg是否通過mTOR信號(hào)通路調(diào)控足細(xì)胞相關(guān)蛋白，為DN的治療提供新的靶點(diǎn)。
　　方法：
　　

2、（1）模型的建立、分組：40只SD雄性大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為2組：正常組（ A組)10只，模型組30只；模型組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozotocin STZ），劑量為55mg/Kg，3天后用血糖儀測(cè)血糖，以隨機(jī)血糖值≥16.7mmol/L且穩(wěn)定5天為DN造模成功；若未達(dá)標(biāo)，另追加50mg/kg STZ，并在追加后3天后復(fù)測(cè)血糖。成功模型組隨機(jī)分為DN組（B組）、DN+他克莫司（tacrolimus FK506）干預(yù)

3、組（C組）、DN+ku0063794干預(yù)組(D組)各10只；C、D組每天分別予FK5061mg/kg/d、ku00637941mg/kg/d灌胃，A組、B組分別予以等量生理鹽水灌胃。實(shí)驗(yàn)0周、4周、8周分別檢測(cè)A、B、C、D四組大鼠體重、血糖、血肌酐、尿肌酐、24小時(shí)尿蛋白定量，ELISA檢測(cè)各組大鼠外周血IL-17、TGF-β1因子，流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)CD4+CD25highTreg細(xì)胞占CD4+T百分比率；4、8周時(shí)處死各組一半大鼠取腎

4、組織利用RT-PCR檢測(cè)Ezrin-mRNA、α-SMA-mRNA及Western blotting檢測(cè)mTOR、Raptor、Rictor、Ezrin、α-SMA蛋白。
　　結(jié)果：
　　(1)生化指標(biāo)①24h尿蛋白定量，組間比較：0周時(shí)，B組、C組、D組較A組明顯升高（P<0.01），B組、C組、D組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；4周時(shí)，B組、C組、D組較 A組明顯升高（ P<0.01）， C組、D組低于 B組（ P<0.05)，D組與

5、C組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；8周時(shí)，B組明顯高于A組（P<0.001）， C組、D組明顯低于B組（P<0.001），A組、C組、D組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。組內(nèi)比較：B組8周明顯高于0周（P<0.05）；C組、D組8周明顯低于0周（P<0.05）。②Ccr，組間比較：4周時(shí)，B組較A組下降（P<0.05），D組高于B組（P<0.05），C組與B組、D組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；8周時(shí)，B組較A組明顯下降（P<0.05），C組、D組明顯高于B組（P<0.05），D組與C

6、組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。組內(nèi)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　(2)Western blotting指標(biāo)：①mTOR蛋白，組間比較：4周時(shí)，B組、C組、D組較A組升高（P<0.05），C組低于B組（P<0.05），D組與B組、C組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；8周時(shí)，B組較A組明顯升高（P<0.05），C組、D組明顯低于B組（P<0.001），A組、C組、D組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。組內(nèi)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。②Raptor蛋白，組間比較：4周、8周時(shí)，B組、C組、D組較A組升高

7、（P<0.05）， C組、D組明顯低于B組（P<0.05），D組與C組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。組內(nèi)比較：C組8周低于4周（P<0.05）。③Rictor蛋白，組間比較：4周時(shí)，B組、C組、D組較A組升高（P<0.05），C組、D組較B組明顯降低（P<0.05），D組與C組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異差異；8周時(shí)，B組較A組明顯升高（P<0.001），C組、D組明顯低于B組（P<0.001），A組、C組、D組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。組內(nèi)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。④Ezrin蛋白，

8、組間比較：4周時(shí)，B組、C組、D組較A組降低（P<0.05）， C組、D組高于B組（P<0.05），D組與C組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；8周時(shí)，B組較A組明顯降低（P<0.05），C組、D組明顯高于B組（P<0.05），A組、C組、D組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。組間比較：B組8周低于4周（P<0.05）。⑤α-SMA蛋白，組間比較：4周時(shí)，B組、C組、D組較A組升高（P<0.05），C組、D組低于B組（P<0.05），D組與C組無統(tǒng)計(jì)差異；8周時(shí)，B組、C組

9、、D組較A組升高（P<0.05），C組、D組明顯低于B組（P<0.05），D組低于C組（P<0.05）。組內(nèi)比較：B組8周高于4周（P<0.05）；C組、D組8周均低于4周（P<0.05）。
　　（3）RT-PCR指標(biāo)：①Ezrin-mRNA，組間比較：4、8周時(shí)，B組、C組、D組較A組降低（P<0.05），C組、D組高于B組P<0.05），C組與D組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。組內(nèi)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。②α-SMA-mRNA，組間

10、比較：4周時(shí)，B組、C組、D組較A組升高（P<0.05）， C組、D組明顯低于B組（P<0.001）， D組與C組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；8周時(shí)，B組、C組較A組升高（P<0.05），C組、D組明顯低于B組（P<0.001），D組與A組、C組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。組內(nèi)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　?。?）流式細(xì)胞學(xué)指標(biāo)：CD4+CD25high Treg百分比，組間比較：4周、8周時(shí)，B組較A組明顯降低(P<0.05)，C、D高于B組（P<0.05），A組

11、、C組、D組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。組內(nèi)比較：B組8周、4周較0周明顯降低（P<0.001）；D組4周高于8周（P<0.05)。
　?。?）ELISA指標(biāo)：①TGF-β1，組間比較：4周時(shí)，B組、D組較A組升高（P<0.05），D組低于B組（P<0.05），C組與A組、B組、D組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；8周時(shí)，B組較A組明顯升高（P<0.05），C組、D組均與A組、B組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，D組高于C組（P<0.001）。組內(nèi)比較：B組、C組、D組4周、8

12、周均高于0周（P<0.05），D組8周高于4周（P<0.05）。②IL-17，組間比較：4周時(shí)，B組、C組較A組升高（P<0.05）， C組、D組低于B組（P<0.05），D組與A組、C組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；8周時(shí)，B組、C組較A組升高（P<0.05），C組與B組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，D組與A組、B組、C組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。組內(nèi)比較：A組8周高于0周（P<0.05）；B組、C組、D組4周、8周明顯高于0周（P<0.05）。（6）相關(guān)性分析：①B組大鼠4周

13、時(shí)，Rictor與與α-SMA-mRNA呈正相關(guān)，與Ezrin、Ezrin-mRNA呈負(fù)相關(guān)；8周時(shí)，Rictor與α-SMA、TGF-β1、IL-17呈正相關(guān)，與Ezrin、CD4+CD25high Treg呈負(fù)相關(guān)；Raptor與 Ezrin、Ezrin-mRNA、α-SMA、α-SMA-mRNA、CD4+CD25high Treg、TGF-β1、IL-17無相關(guān)。②B組大鼠4周、8周時(shí)，CD4+CD25high Treg與TGF-

14、β1蛋白呈均負(fù)相關(guān)。③B組大鼠4周、8周 Ezrin-mRNA與 CD4+CD25high Treg均呈正相關(guān)；8周時(shí)， Ezrin、Ezrin-mRNA與TGF-β1、IL-17負(fù)相關(guān)；④B組大鼠4周時(shí)，α-SMA-mRNA與IL-17呈正相關(guān)，與CD4+CD25high Treg負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1、阻斷mTOR通路DN大鼠腎臟能升高腎小球?yàn)V過率、降低尿蛋白、改善大鼠精神狀態(tài)。
　　2、mTORC2信號(hào)通路