β-arrestins在糖尿病腎病足細(xì)胞損傷中的作用及機制.pdf

1、糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病的微血管病變，也是導(dǎo)致終末期腎病(end stage of renal disease，ESRD)的重要原因之一。雖然大量的研究證實異常的脂質(zhì)代謝，氧化應(yīng)激，腎素血管緊張素系統(tǒng)的失調(diào)，炎性反應(yīng)，體內(nèi)血流動力學(xué)的改變以及遺傳因素均是糖尿病腎病發(fā)病的重要因素，但針對以上因素進(jìn)行干預(yù)并不能有效阻滯糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展，因此深入探討糖尿病腎病的發(fā)病機制，尋找新的藥物靶點具有重要

2、意義。
　　Arrestins是具有多種功能的小分子蛋白，家族有四個成員，arrestin1(visualarrestin)與arrestin4(cone arrestin)特異性的分布在調(diào)節(jié)光感相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的視覺系統(tǒng)組織中。其中arrestin3（β-arrestin-1(Arrb1)）和arrestin4（β-arrestin-2(Arrb2)）兩個亞型在心臟、大腦、垂體、脾、肝臟、腎臟、胰腺等組織中廣泛表達(dá)，并具有78％的

3、氨基酸序列相同。β-arrestins基本結(jié)構(gòu)是由兩個反向平行的β折疊片組成，通過鉸鏈區(qū)與氨基端短α螺旋相連。β-arrestins主要有兩個功能區(qū)，N端和C端功能區(qū)，N端功能區(qū)負(fù)責(zé)識別已被激活的G蛋白偶聯(lián)受體(Gprotein-coupled receptors，GPCRs)，C端功能區(qū)是第二受體識別區(qū)。最初研究發(fā)現(xiàn)β-arrestins作為GPCRs的負(fù)性調(diào)控因子，通過介導(dǎo)GPCRs的脫敏、內(nèi)吞、降解導(dǎo)致信號轉(zhuǎn)導(dǎo)減弱或終止而發(fā)揮作用

4、。近些年來發(fā)現(xiàn)β-arrestins可以作為橋梁蛋白或支架蛋白作用于細(xì)胞內(nèi)多種信號分子，調(diào)節(jié)胞外信息向胞內(nèi)的傳遞，影響機體細(xì)胞的增殖、凋亡以及免疫應(yīng)答反應(yīng)，與心血管、呼吸、內(nèi)分泌、神經(jīng)和免疫等系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但在糖尿病腎病中的作用尚無報道。
　　足細(xì)胞(podocyte)，即腎小囊臟層上皮細(xì)胞，它附著于腎小球基底膜(glomerular basement membrane，GBM)的外側(cè)，與基底膜和毛細(xì)血管內(nèi)皮一起構(gòu)成了腎

5、小球血液濾過屏障。足細(xì)胞損傷是糖尿病腎病的早期事件，足細(xì)胞的脫落或者凋亡引起腎小球濾過屏障破壞，蛋白尿的發(fā)生，最終導(dǎo)致ESRD。大量的研究表明多種信號通路參與糖尿病腎病中足細(xì)胞的損傷，其中足細(xì)胞自噬水平的降低在腎臟足細(xì)胞損傷中起到重要作用，但在糖尿病腎病中自噬的變化以及具體的調(diào)控機制尚不清楚。因此深入研究自噬在糖尿病腎病中的作用及調(diào)控機制具有重要的意義。
　　目的:
　　1、明確β-arrestins在糖尿病腎病中表達(dá)變化及

6、其在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　2、闡明β-arrestin-1和β-arrestin-2在足細(xì)胞損傷中的作用及分子機制。
　　3、探討β-arrestin-1與β-arrestin-2調(diào)控足細(xì)胞自噬水平的機制。
　　方法:
　　第一部分 -arrestin-1/2在糖尿病腎病中的表達(dá)與作用
　　1.1在糖尿病腎病腎活檢樣本中β-arrestin-1與β-arrestin-2表達(dá)檢測
　　獲取正

7、常、糖尿病非腎病(diabetic mellitus non-nephropathy, DM-NN)及糖尿病腎病病人腎穿刺樣本，免疫組化(immunohistochemical，IHC)與實時定量RT-PCR檢測樣本內(nèi)β-arrestin-1與β-arrestin-2蛋白和mRNA水平的變化。同時收集病人生理指標(biāo)與腎臟相關(guān)指標(biāo)，分析病人腎臟功能損傷與β-arrestins表達(dá)的相關(guān)性。
　　1.2動物學(xué)研究
　　1.2.1

8、STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠腎皮質(zhì)組織中β-arrestin-1與β-arrestin-2表達(dá)檢測:
　　雄性野生型(wild type，WT) C57BL/6J小鼠，年齡6-8周，隨機分組，先手術(shù)切除一側(cè)腎臟，恢復(fù)一周左右，每天腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)100mg/kg的劑量連續(xù)三天誘導(dǎo)Ⅰ型糖尿病腎病。檢測空腹血糖(＞16mmol/l)、24h尿蛋白等指標(biāo)確定糖尿病腎病造模是否成功。采用實時定量RT-P

9、CR與蛋白免疫印跡(western blot，WB)檢測β-arrestin-1和β-arrestin-2在野生型小鼠腎皮質(zhì)中的表達(dá)情況。在野生型小鼠腎臟石蠟切片中采用原位雜交(in stu hybridization，ISH)與IHC的方法檢測β-arrestin-1和β-arrestin-2的表達(dá)部位與表達(dá)變化。在野生型小鼠腎臟石蠟切片中采用免疫熒光雙標(biāo)(immunofluorescence，IF)的方法，檢測小鼠腎臟中β-arre

10、stins與腎小球足細(xì)胞的共定位。除此之外，進(jìn)一步就自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)變化進(jìn)行檢測。
　　1.2.2Ⅱ型糖尿病腎病db/db小鼠腎皮質(zhì)組織中β-arrestin-1與β-arrestin-2的表達(dá)檢測
　　采用WB檢測db/+組小鼠與db/db組小鼠腎皮質(zhì)組織中β-arrestin-1與β-arrestin-2表達(dá)的變化。
　　1.2.3基因敲除Arrb1/2對腎臟功能的影響
　　雄性β-arrestin-1(A

11、rrb1-/-)與β-arrestin-2(Arrb2-/-)敲基因小鼠，周齡6-8周，體重22±2g。摘單腎加腹腔注射STZ誘導(dǎo)Ⅰ型糖尿病腎病模型（具體操作與檢測同前面野生型小鼠造模方法）。
　　Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)試劑盒檢測糖尿病腎病小鼠尿微量白蛋白，以及肌酐試劑盒檢測尿肌酐的含量。計算得出野生型以及敲基因小鼠正常與模型對照組的尿微量白蛋白與尿肌酐的比值(urinar

12、ymicroalbuminuria/creatinine ratio，UACR)。采用WB檢測野生型和基因敲除小鼠腎皮質(zhì)組織中自噬相關(guān)蛋白的變化（LC3與ATG12-ATG5）。在石蠟切片中，過碘酸雪夫染色(periodic acid-schiff stain，PAS)檢測敲基因小鼠與野生型小鼠腎臟損傷形態(tài)學(xué)的變化。采用透射電鏡(transmission electron microscope，TEM)觀察野生型和基因敲除小鼠腎臟超微結(jié)

13、構(gòu)的變化。同時用ImageJ軟件分析基底膜厚度(GBM thickness)、足細(xì)胞寬度(foot process width)以及單位長度基底膜下足細(xì)胞的個數(shù)(number of foot process/μmGBM)。
　　1.3體外實驗研究
　　1.3.1β-arrestin-1與β-arrestin-2在足細(xì)胞中的表達(dá)變化
　　體外培養(yǎng)腎小球足細(xì)胞，體外模擬糖尿病腎病病理狀態(tài)，WB檢測腎小球足細(xì)胞在高糖（hig

14、h glucose，HG）、糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation endproducts，AGE)和轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)等刺激下β-arrestin-1與β-arrestin-2表達(dá)的變化。
　　第二部分 β-arrestin-1/2對足細(xì)胞自噬水平的調(diào)控及機制研究
　　2.1β-arrestins表達(dá)的干預(yù)及其對足細(xì)胞自噬水平的影響

15、r>　　分別轉(zhuǎn)染shRNA-β-arrestin-1和shRNA-β-arrestin-2質(zhì)粒，基因沉默足細(xì)胞中β-arrestin-1和β-arrestin-2的表達(dá)。WB檢測Arrb1和Arrb2沉默后HG刺激下足細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的變化;TEM觀察Arrb1和Arrb2沉默對足細(xì)胞自噬的影響;采用腺病毒作為載體的GFP-LC3-RFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染足細(xì)胞，檢測Arrb1和Arrb2基因沉默對足細(xì)胞自噬流的影響。
　　2.2 Ar

16、rb1與Arrb2基因沉默介導(dǎo)的自噬激活對足細(xì)胞功能的影響
　　流式細(xì)胞儀檢測自噬抑制劑3-Methyladenine(3-MA)與沉默自噬相關(guān)基因ATG3對足細(xì)胞凋亡的影響。流式細(xì)胞儀檢測Arrb1和Arrb2基因的沉默與過表達(dá)以及雷帕霉素（Rapamycin）、氯喹(Chloroquine)和巴伐洛霉素A1（Bafilomycin A1）的干預(yù)對足細(xì)胞凋亡的影響。
　　2.3β-arrestins對PI3K復(fù)合物的影響檢

17、測
　　免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，Co-IP)檢測β-arrestin-1和β-arrestin-2與beclin-1和VPS34的相互作用，Co-IP檢測β-arrestin-1和β-arrestin-2沉默對beclin-1和VPS34結(jié)合的影響。
　　2.4β-arrestins對ATG12-ATG5結(jié)合影響檢測
　　Co-IP檢測β-arrestin-1和β-arrestin-2

18、與ATG7的相互作用。WB檢測Arrb1和Arrb2沉默后ATG12-ATG5復(fù)合物的變化。
　　結(jié)果:
　　第一部分 β-arrestin-1/2在糖尿病腎病中的表達(dá)與作用
　　1.1糖尿病腎病患者腎活檢標(biāo)本中β-arreestin-1/2的表達(dá)變化
　　IHC發(fā)現(xiàn)在糖尿病腎病患者腎活檢標(biāo)本中β-arrestin-1和β-arrestin-2的表達(dá)量都明顯上調(diào);糖尿病腎病腎活檢樣本中β-arrestin-1和β

19、-arrestin-2的mRNA水平較正常人群顯著升高;相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)β-arrestin-1(Spearmanr=-0.7471，P＜0.01)和β-arrestin-2(Spearman r=-0.7845，P＜0.01)的mRNA水平與estimatedglomerular filtration rate(eGFR)成負(fù)相關(guān)。表明β-arrestin-1和β-arrestin-2的過表達(dá)與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。
　　1.

20、2動物學(xué)研究
　　1.2.1 STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠腎臟組織中β-arrestin-1/2表達(dá)的變化
　　單腎切除加腹腔注射STZ后飼養(yǎng)12周可成功建立DN小鼠模型。ISH與IHC實驗均證實在DN小鼠腎皮質(zhì)中β-arrestin-1和β-arrestin-2的表達(dá)在腎小球與腎小管中均有明顯升高。實時定量RT-PCR與WB檢測結(jié)果顯示DN小鼠腎皮質(zhì)中Arrb1和Arrb2的mRNA與蛋白水平均升高。
　　1.2.2Ⅱ型糖

21、尿病腎病db/db小鼠腎皮質(zhì)組織中β-arrestin-1/2表達(dá)的變化WB檢測發(fā)現(xiàn)與db/+正常對照小鼠相比較，db/db小鼠腎皮質(zhì)組織中β-arrestin-1和β-arrestin-2的表達(dá)明顯升高。
　　1.2.3基因敲除Arrb1/2能夠減輕糖尿病腎病小鼠腎臟損傷
　　單側(cè)腎摘除外加腹腔注射STZ誘導(dǎo)的DN小鼠模型中，Arrb1-/-和Arrb2-/-基因敲除組腎臟損傷明顯減輕，UACR明顯降低，PAS染色顯示腎小

22、球系膜增生以及糖原沉積明顯減少，TEM觀察顯示腎臟超微結(jié)構(gòu)的改善:基底膜厚度明顯降低，足細(xì)胞的寬度也明顯降低，足細(xì)胞足突脫落以及足突融合的明顯減少，足細(xì)胞個數(shù)明顯增加。
　　1.2.4基因敲除Arrb1/2能夠增加體內(nèi)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)
　　WB結(jié)果顯示，糖尿病腎病小鼠腎臟皮質(zhì)組織中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值以及ATG12-ATG5復(fù)合物明顯降低，Arrb1-/-和Arrb2-/-基因敲除后能明顯增加糖尿病腎病小鼠腎皮質(zhì)組織中L

23、C3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值以及ATG12-ATG5復(fù)合物。
　　1.3體外實驗研究
　　1.3.1高糖條件下足細(xì)胞內(nèi)β-arrestin-1/2的表達(dá)變化
　　用synaptopodin抗體特異性標(biāo)記足細(xì)胞，檢測糖尿病腎病小鼠足細(xì)胞中β-arrestin-1和β-arrestin-2表達(dá)變化。結(jié)果顯示足細(xì)胞中β-arrestin-1和β-arrestin-2的表達(dá)明顯升高，而且在DN小鼠腎小管內(nèi)β-arrestin-2的升

24、高較β-arrestin-1更明顯。WB檢測足細(xì)胞在模擬體內(nèi)DN環(huán)境的損傷因子HG，AGE，TGF-β1的刺激下β-arrestin-1和β-arrestin-2蛋白表達(dá)明顯升高并且具有濃度依賴性。
　　第二部分 β-arrestin-1/2對足細(xì)胞自噬水平的調(diào)控及機制研究
　　2.1 Arrb1/2基因沉默促進(jìn)高糖環(huán)境下足細(xì)胞自噬的恢復(fù)
　　分別轉(zhuǎn)染shRNA-β-arrestin-1和shRNA-β-arresti

25、n-2質(zhì)粒，WB檢測轉(zhuǎn)染沉默效率，結(jié)果顯示β-arrestin-1和β-arrestin-2蛋白表達(dá)有50％左右的降低。TEM觀察顯示Arrb1和Arrb2基因沉默能明顯增加足細(xì)胞內(nèi)的自噬小體的數(shù)目。WB檢測發(fā)現(xiàn)Arrb1和Arrb2沉默后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高。轉(zhuǎn)染足細(xì)胞腺病毒GFP-LC3-RFP質(zhì)粒，標(biāo)記足細(xì)胞內(nèi)自噬小體以及自噬溶酶體的變化，應(yīng)用激光共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)Arrb1和Arrb2沉默后不僅能增加自噬小體的數(shù)目（黃色顆粒）

26、還能增加自噬溶酶體（紅色顆粒）的數(shù)目。
　　2.2 Arrb1/2基因沉默介導(dǎo)的自噬的激活抑制足細(xì)胞凋亡
　　我們采用兩種方法檢測自噬抑制對足細(xì)胞的影響，加入自噬抑制劑3-MA后足細(xì)胞的凋亡明顯升高，基因沉默自噬相關(guān)基因ATG3后，足細(xì)胞的凋亡較陰性對照組(Scramble)也有明顯的升高，提示自噬對足細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。
　　實驗結(jié)果顯示HG刺激下，足細(xì)胞的凋亡有所增加，Arrb1和Arrb2的基因沉默以及自噬激活

27、劑Rapamycin的干預(yù)都能明顯減少足細(xì)胞的凋亡。轉(zhuǎn)染β-arrestin-1和β-arrestin-2過表達(dá)質(zhì)粒組相對于Scramble組足細(xì)胞的凋亡有明顯的升高，而且足細(xì)胞的凋亡可以被自噬激活劑Rapamycin的干預(yù)所抑制，提示Arrb1和Arrb2的基因沉默介導(dǎo)的自噬的激活可以降低足細(xì)胞的凋亡。
　　2.3β-arrestin-1/2對Ⅲ型PI3K復(fù)合物的影響
　　Co-IP檢測發(fā)現(xiàn)在足細(xì)胞中β-arrestin-

28、1和β-arrestin-2分別與beclin-1和VPS34有結(jié)合，而且在HG刺激下它們的結(jié)合還有所升高，但是Arrb1和Arrb2基因沉默后并不影響beclin-1與VPS34的結(jié)合。
　　2.4β-arrestin-1/2負(fù)調(diào)控ATG12-ATG5結(jié)合抑制足細(xì)胞自噬
　　Co-IP檢測顯示，β-arrestin-1和β-arrestin-2分別與ATG7有結(jié)合，而且在HG刺激下，它們的結(jié)合有所升高。轉(zhuǎn)染過表達(dá)β-arr

29、estin-1和β-arrestin-2后，足細(xì)胞內(nèi)LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值以及ATG12-ATG5復(fù)合物顯著降低，轉(zhuǎn)染沉默Arrb1和Arrb2后，足細(xì)胞內(nèi)LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值以及ATG12-ATG5復(fù)合物明顯升高。提示β-arrestin-1和β-arrestin-2與ATG7的結(jié)合，減少了游離的ATG7，降低影響ATG7催化下游ATG12-ATG5復(fù)合物的形成以及LC3的轉(zhuǎn)化，抑制足細(xì)胞的自噬，加劇足細(xì)胞的損傷與凋亡。

30、　　結(jié)論及創(chuàng)新性:
　　1.β-arrestin-1/2在糖尿病腎病足細(xì)胞損傷中起到了重要作用。高糖刺激下，β-arrestin-1/2在足細(xì)胞內(nèi)表達(dá)升高，降低足細(xì)胞內(nèi)的自噬，增加足細(xì)胞凋亡，致使足細(xì)胞脫落，腎小球的過濾屏障被破壞，產(chǎn)生蛋白尿引起腎損傷?；蚯贸蚋蓴_沉默Arrb1和Arrb2后能增加足細(xì)胞的自噬，并改善糖尿病腎病的腎損傷。
　　2.β-arrestin-1/2降低足細(xì)胞自噬水平的機制是:β-arrestin