細胞自噬在糖尿病大鼠脊髓損傷中的作用及其機制研究.pdf

1、目的:在糖尿病大鼠脊髓損傷中研究細胞自噬與細胞凋亡的變化，并進一步探討研究自噬與凋亡的關系;其次，在體外細胞實驗明確自噬在高糖加重的氧化損傷神經(jīng)細胞中所起的作用。
　　方法:采用STZ注射及血管夾脊髓夾閉損傷建立糖尿病脊髓損傷模型，隨機分組為假手術組，脊髓損傷組，糖尿病脊髓損傷組。術后第3，7，14，21及28天采用BBB評分及斜板試驗對各組運動功能進行評估。術后第7天組織采用HE染色檢測脊髓損傷后組織學變化，采用尼氏染色及免疫組

2、化（標記NeuN）檢測受損脊髓的神經(jīng)元丟失情況，采用免疫熒光染色（標記CD45）及免疫組化染色（標記CD68）檢測脊髓損傷后炎癥反應情況，采用免疫組化染色（標記GFAP）檢測損傷后星型膠質(zhì)細胞增生情況;采用免疫組化，熒光雙染(TUNEL/NeuN)及Western blot檢測各組凋亡水平變化;采用透射電鏡，免疫組化及Western blot檢測各組自噬水平變化。并進一步采用自噬激動劑處理糖尿病脊髓損傷組，觀察激活自噬對糖尿病大鼠脊髓損

3、傷后細胞凋亡，神經(jīng)性損傷及運動功能的影響。最后以氧化損傷的PC12細胞為體外模型，培育以含或不含雷帕霉素的高糖培養(yǎng)基，采用CCK-8檢測細胞活力;采用免疫熒光，Western blot檢測自噬水平;采用免疫細胞化學染色，TUNEL法及Western blot檢測凋亡水平。
　　結果:BBB評分及斜板試驗結果顯示糖尿病延緩大鼠脊髓損傷后運動功能的恢復;HE染色結果顯示糖尿病能加重大鼠受損脊髓組織形態(tài)學破壞;尼氏染色及免疫組化（標記N

4、euN）結果顯示糖尿病顯著增加脊髓損傷后的神經(jīng)元丟失;免疫熒光染色（標記CD45）及免疫組化染色（標記CD68）結果顯示糖尿病增加脊髓損傷病灶的炎癥反應，且免疫組化染色（標記GFAP）結果反應糖尿病能增強受損脊髓中的星型膠質(zhì)細胞增生。免疫組化，熒光雙染(TUNEL/NeuN)及Western blot檢測結果顯示糖尿病大鼠脊髓損傷組較脊髓損傷組的細胞凋亡水平顯著上升;透射電鏡，免疫組化及Western blot檢測顯示糖尿病能進一步激活

5、脊髓損傷后的細胞自噬。利用雷帕霉素上調(diào)糖尿病大鼠脊髓損傷后的自噬水平后，運動功能得以改善，神經(jīng)性損傷明顯減輕及凋亡水平顯著下降。體外細胞實驗結果顯示，在高糖環(huán)境下，氧化損傷后的PC12細胞活性明顯下降，凋亡和自噬水平顯著上升;雷帕霉素在體外上調(diào)自噬水平后，高糖誘導下的細胞凋亡明顯下降，細胞活力顯著提高。
　　結論:1.STZ誘導的糖尿病能顯著加重大鼠脊髓損傷后的神經(jīng)元丟失，炎癥反應及星型膠質(zhì)細胞增生，并抑制運動功能的恢復。于此同時