TGF-β-Smad信號(hào)蛋白在糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制中的作用.pdf

1、糖尿病腎病是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，也是西方國(guó)家終末期腎病(ESRD)的首位病因。已有的研究表明，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)可刺激腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞的肥大，并通過(guò)增加細(xì)胞外基質(zhì)的合成，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解而導(dǎo)致腎小球系膜區(qū)及腎小管．間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)的積聚，最后導(dǎo)致腎小球硬化、腎小管．間質(zhì)纖維化和腎血管硬化，發(fā)生腎衰竭。應(yīng)用抗TGF-β抗體或TGF-β反義寡核苷酸治療可顯著減少細(xì)胞外基質(zhì)

2、的積聚，減輕腎臟纖維化。有足夠的證據(jù)提示TGF-β在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。 目的：探討鏈脲佐菌素(Streptozocin,STZ)誘導(dǎo)的大鼠糖尿病腎病模型腎組織中Smad信號(hào)蛋白的活化狀態(tài)。方法：1、動(dòng)物分組和模型建立：雄性SD大鼠48只，體重200-250g，分別于成模后4、6、8、10、12、14、16周殺檢6只。另設(shè)正常對(duì)照組6只。雄性SD大鼠禁食16h后腹腔注射STZ(60mg／kg體重)，并于開(kāi)始注

3、射STZ后72h后取大鼠尾靜脈血測(cè)血糖，凡血糖≥16.7mmol／L確定為糖尿病大鼠模型制作成功。對(duì)照組腹腔注射等體積的枸櫞酸緩沖液。2、檢測(cè)指標(biāo)：觀察大鼠一般情況，測(cè)體重、腎重、血糖、血壓、尿白蛋白排泄率、血肌酐，24小時(shí)尿量；留取大鼠腎組織做PAS及Masson染色；用RT-PCR檢測(cè)大鼠腎組織TGF-β 1、Smad2、Smad3、α-SMA、E-cadherin mRNA水平;免疫組織化學(xué)檢測(cè)大鼠腎組織中p-Smad2／3、α-

4、SMA和E-cadherin的表達(dá)；Western-blot檢測(cè)大鼠腎組織α-SMA和E-cadherin的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：1、大鼠糖尿病腎病模型的建立。腹腔注射STZ后，糖尿病大鼠出現(xiàn)明顯的多食、多飲、多尿和體重下降等糖尿病癥狀，血糖明顯升高，腎小球體積增大，腎重／體重比值增加，腎小球基底膜增厚，系膜基質(zhì)明顯增寬，尿白蛋白排泄率明顯增加，血肌酐水平增高，表明大鼠糖尿病腎病模型已成功建立。2、大鼠糖尿病腎病腎內(nèi)TGF β／Smad信

5、號(hào)蛋白的活化狀態(tài)。與對(duì)照組大鼠相比，糖尿病大鼠腎臟組織內(nèi)TGF-β 1、Smad2和Smad3 mRNA水平顯著增高。正常大鼠腎小管上皮細(xì)胞有p-Smad2／3的基礎(chǔ)表達(dá)，隨著糖尿病病情的進(jìn)展，p-Smad2／3在糖尿病形成后6周顯著增高，高峰出現(xiàn)在8周和16周。3、大鼠糖尿病腎病腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。 第二節(jié)　兩種糖尿病動(dòng)物模型腎組織中Smad蛋白活化狀態(tài)的對(duì)比研究 目的：對(duì)比兩種糖尿病腎病動(dòng)物模型腎組織中Smad蛋白

6、活化狀態(tài)。方法： 1、動(dòng)物分組：將40只雄性SD大鼠(160-210g)隨機(jī)分成4組，A組：正常對(duì)照組(Con組,n=8)，注射枸櫞酸緩沖液；B組：?jiǎn)文I切除組(Nx組，n=8)，大鼠接受右側(cè)腎切除術(shù)，2周后腹腔注射枸櫞酸緩沖液；C組：糖尿病腎病組(DM組，n=12)，單劑量腹腔注射STZ(60 mg／kg體重)：D組：?jiǎn)文I切除+糖尿病組(DMNx組，n=12)，大鼠接受右側(cè)腎切除術(shù)，2周后單劑量腹腔注射STZ(50mg／kg體重

7、)。觀察16周后收集標(biāo)本。2、檢測(cè)指標(biāo)：觀察大鼠一般情況，各組大鼠測(cè)體重、腎重、血糖、血壓、尿白蛋白排泄率、血肌酐，24小時(shí)尿量；留取各組大鼠腎組織做PAS及Masson染色；用RT-PCR檢測(cè)各組大鼠腎組織TGF-β<,1>、Smad2、Smad3、α-SMA、E-cadherin mRNA水平；免疫組織化學(xué)檢測(cè)各組大鼠腎組織中p-Smad2／3、α-SMA和E-cadhefin的表達(dá)；Western-blot檢測(cè)各組大鼠腎組織α-S

8、MA和E-cadherin的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：1、兩種糖尿病腎病動(dòng)物模型一般情況的比較。與DM組相比較，DMNx組大鼠腎重／體重比值增加，系膜基質(zhì)明顯增多，尿白蛋白排泄率明顯增加。DMNx組大鼠腎小管間質(zhì)出現(xiàn)局灶性纖維化。但兩組之間的血壓，血肌酐水平差異無(wú)顯著性。2、兩種糖尿病動(dòng)物模型腎組織中Smad蛋白活化狀態(tài)的比較。與Con組及Nx組相比較，DM組與DMNx組大鼠腎臟組織中。TGF-β<,1>、Smad2和Smad3 mRNA的表

9、達(dá)水平均顯著增高，且DMNx組較DM組升高更明顯。與Con組及Nx組相比較，DM組與。DMNx組大鼠腎小管上皮細(xì)胞p-Smad2／3的蛋白表達(dá)水平顯著增高，且DMNx組較DM組升高更明顯。3、兩種糖尿病動(dòng)物模型腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的比較。與Con組及Nx組相比較，DM組與DMNx組大鼠腎臟組織中α-SMAmRNA的表達(dá)水平均顯著增高，且DMNx組較DM組升高更明顯；而E-cadherin mRNA的表達(dá)水平顯著降低，且DMNx組較DM組

10、降低更明顯。免疫組織化學(xué)及Westernblot結(jié)果表明，與Con組及Nx組相比較，DM組與DMNx組大鼠腎小管上皮細(xì)胞α-SMA的蛋白表達(dá)水平顯著增高，且DMNx組較DM組升高更明顯；而E-cadherin的蛋白表達(dá)水平顯著降低，且DMNx組較DM組降低更明顯。結(jié)論：?jiǎn)文I切除后STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎病模型與單純STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎病模型均存在Smad信號(hào)蛋白的活化及腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，且前者的活化程度及轉(zhuǎn)分化程度均強(qiáng)于后者。

11、第二章TGF-β<,1>和高糖對(duì)腎小管上皮細(xì)胞Smad信號(hào)蛋白的影響 第一節(jié)TGF-β<,1>對(duì)近端腎小管上皮細(xì)胞Smad信號(hào)蛋白的影響 目的：探討TGF-β<,1>對(duì)近端腎小管上皮細(xì)胞Smad信號(hào)蛋白的影響。方法：1、細(xì)胞培養(yǎng)：待生長(zhǎng)狀況良好的NRK52E細(xì)胞60-80％貼壁后，無(wú)血清培養(yǎng)基同步24小時(shí)，然后給予不同濃度和時(shí)間TGF-β<,1>刺激。2、指標(biāo)檢測(cè)：采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)0、2、4、8、10ng／m

12、l的TGF-β<,1>濃度刺激30分鐘，以及TGF-β<,1>(10ng／ml)刺激0、15min、30min、lh、3h后p-Smad2／3核轉(zhuǎn)位情況；RT-PCR檢測(cè)0h、6h、12h、24h、48h、72h，120不同時(shí)間點(diǎn)Smad2、Smad3、α-SMA、E-cadherin和Collagen I mRNA的表達(dá)；Western blot方法檢測(cè)Oh、24h、48h、72h不同時(shí)間點(diǎn)α-SMA、E-cadherin蛋白的表達(dá)水

13、平。結(jié)果：與刺激前比較，TGF-β<,1>以時(shí)間和劑量依賴方式上調(diào)NRK52E細(xì)胞p-Smad2／3核轉(zhuǎn)位，高峰發(fā)生在30min(73.1％VS 15.8％陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù))；與刺激前比較TGF-β<,1>以時(shí)間依賴方式上調(diào)Smad2、Smad3、Smad7和Collagen I mRNA的表達(dá)，上調(diào)α-SMA mRNA和蛋白的表達(dá)，下調(diào)E-Cadherin mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)論：TGF-β<,1>能活化近端腎小管上皮細(xì)胞Smad信

14、號(hào)蛋白，并促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和細(xì)胞外基質(zhì)的生成。 第二節(jié) 高糖對(duì)近端腎小管上皮細(xì)胞Smad信號(hào)蛋白的影響 目的：探討高糖對(duì)近端腎小管上皮細(xì)胞Smad信號(hào)蛋白的影響。方法：1、細(xì)胞培養(yǎng)：待生長(zhǎng)狀況良好的NRK52E細(xì)胞60-80％貼壁后，無(wú)血清培養(yǎng)基同步24小時(shí)，然后分高糖組(35mmol／L)和甘露醇對(duì)照組(35mmol／L)。2、指標(biāo)檢測(cè)：采用細(xì)胞免疫化學(xué)方法檢測(cè)5.5、15、25、35、45mmol／L不同葡萄

15、糖濃度刺激24h，以及高糖刺激0、15min、30min、lh、3h、6h、12h、24h、48h后p-Smad2／3核轉(zhuǎn)位情況；RT-PCR檢測(cè)Oh、12h、24h、48h、72h不同時(shí)間點(diǎn)Smad2、Smad3、Smad7、TGF-β<,1>、α-SMA、E-cadherin和Collagen I mRNA的表達(dá)。結(jié)果：與刺激前和甘露醇對(duì)照組比較，高糖明顯上調(diào)NRK52E細(xì)胞p-Smad2／3核轉(zhuǎn)位，高峰在24小時(shí)；上調(diào)Smad2、

16、Smad3、Smad7、TGF-β<,1>、α-SMA和CollagenI mRNA的表達(dá)；下調(diào)E-Cadherin mRNA的表達(dá)。結(jié)論：高糖能活化近端腎小管上皮細(xì)胞Smad信號(hào)蛋白，并促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和細(xì)胞外基質(zhì)的生成。 第三章Smad7對(duì)高糖介導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和細(xì)胞外基質(zhì)合成的影響 目的：探討Smad7對(duì)高糖介導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響。方法：1、強(qiáng)力霉素(Dox)調(diào)控Smad7表達(dá)NRK52E細(xì)

17、胞株的構(gòu)建：應(yīng)用lipofect 2000將含有小鼠全長(zhǎng)Smad7 cDNA的Tet-on質(zhì)粒系統(tǒng)先后轉(zhuǎn)染至正常大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞(NRK52E)，G418培養(yǎng)基和含有潮霉素的培養(yǎng)基兩輪篩選后，最后通過(guò)鑒定選擇Smad7表達(dá)受Dox調(diào)控的克隆，擴(kuò)增后凍存?zhèn)溆谩?、細(xì)胞培養(yǎng)：待生長(zhǎng)狀況良好的轉(zhuǎn)染Smad7的NRK52E細(xì)胞株60％-80％細(xì)胞貼壁后，無(wú)血清培養(yǎng)基同步24小時(shí)，然后分為Dox誘導(dǎo)組和對(duì)照組，前者給予Dox(2ug／m1)

18、誘導(dǎo)24h后，給予高糖刺激，后者不加Dox誘導(dǎo)。3、指標(biāo)檢測(cè)：采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)高糖刺激0、24h后p-Smad2／3核轉(zhuǎn)位情況；RT-PCR檢測(cè)Oh、12h、24h、48h、72h不同時(shí)間點(diǎn)Smad2、Smad3、Smad7、TGF-β1、α-SMA、E-cadherin和Collagen ImRNA的表達(dá)；Western blot方法檢測(cè)Oh、48h、72h不同時(shí)間點(diǎn)α-SMA、E-cadherin和Collagen I蛋白的