維生素C通過(guò)激活蛋白激酶B抑制TGF-β信號(hào)通路改善糖尿病腎病的作用和機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy，DN)是糖尿病引起的微血管慢性并發(fā)癥之一，也是全球范圍終末期腎病(End-Stage Renal Disease，ESRD)的主要原因。由于糖尿病治療方法的改進(jìn)，病人生存時(shí)間的延長(zhǎng)，使得糖尿病并發(fā)癥發(fā)生率大為增加。DN發(fā)病機(jī)理到目前為止尚不明確，由血流動(dòng)力學(xué)、代謝異常和血管活性物質(zhì)之間的相互作用所導(dǎo)致的腎小球硬化和腎小管-間質(zhì)纖維化在DN的形成與發(fā)展中起著至關(guān)重要的

2、作用。尤以腎小球系膜細(xì)胞為主的細(xì)胞外基質(zhì)增多為DN發(fā)病的主要原因。DN尚無(wú)特異的治療藥物，目前臨床主要通過(guò)改善血糖、控制血壓，例如應(yīng)用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)或血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑可延緩腎病進(jìn)展。在積極闡明DN發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)上，尋找DN的防治藥物是一項(xiàng)迫切任務(wù)。
　　在糖尿病人和糖尿病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中，由于高血糖和過(guò)氧化導(dǎo)致血清中維生素C(VC)濃度降低。因此，VC可能是改善DN的潛在藥物。我們通過(guò)比較VC和維生素E（V

3、E，對(duì)照）在改善DN中的作用，明確VC在治療DN中的效應(yīng)并明確抗氧化作用的地位，并探索其可能的作用機(jī)制。
　　方法和結(jié)果：
　　1.利用STZ誘導(dǎo)Gulo-/-小鼠，剝奪VC對(duì)DN的作用及可能的作用機(jī)制
　　人類(lèi)自身無(wú)法合成VC，缺乏VC合成必需的酶：L-古洛糖酸內(nèi)酯氧化酶(Gulo)。嚙齒類(lèi)大鼠和小鼠能自身合成VC，我們成功利用TALEN技術(shù)制作了L-古洛糖酸內(nèi)酯氧化酶基因敲除的小鼠，補(bǔ)充VC（4g/L飲水中加入）完

4、全可以糾正體內(nèi)VC的缺乏狀態(tài)。在Gulo-/-小鼠中，剝奪VC加重STZ誘導(dǎo)的蛋白尿，加重系膜擴(kuò)張，并使腎小球α-SMA表達(dá)顯著增加和細(xì)胞外基質(zhì)累積。剝奪VC從形態(tài)和功能上加重腎小球的損傷。
　　2.利用STZ誘導(dǎo)SD糖尿病大鼠，補(bǔ)充VC和VE對(duì)改善DN的作用及可能的作用機(jī)制
　　利用STZ誘導(dǎo)的大鼠模型，補(bǔ)充VC和VE，確定VC的作用和特異性。補(bǔ)充VC顯著降低STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠尿蛋白，而VE卻沒(méi)有相似的作用。進(jìn)一步通過(guò)

5、腎小球?yàn)V過(guò)實(shí)驗(yàn)，腎小球重吸收實(shí)驗(yàn)和尿液滲透壓實(shí)驗(yàn)，確定VC的作用靶部位是腎小球或腎小管。補(bǔ)充VC明顯降低肌酐清除率（腎小球?yàn)V過(guò)率），而VE卻沒(méi)有相似的作用。補(bǔ)充VC和VE對(duì)腎小球重吸收和尿液滲透壓均沒(méi)有影響。補(bǔ)充VC使腎小球α-SMA表達(dá)顯著降低和nephrin表達(dá)增加。補(bǔ)充VC不僅僅改善腎臟功能，并且抑制腎小球硬化，但是VE卻沒(méi)有相似的作用。
　　3.利用2型糖尿病db/db小鼠，補(bǔ)充VC和VE對(duì)DN的作用及可能的作用機(jī)制

6、>　　我們利用2型糖尿病模型，db/db小鼠，補(bǔ)充VC和VE，確定VC的作用和特異性。補(bǔ)充VC顯著降低糖尿病db/db小鼠模型的尿蛋白，但是VE卻沒(méi)有相似的作用。補(bǔ)充VC使腎小球α-SMA表達(dá)和細(xì)胞外基質(zhì)累積顯著降低，但是VE卻沒(méi)有相似的作用。
　　4.利用大鼠系膜細(xì)胞(Rat mesangial cells，RMCs)探索深層的分子機(jī)制
　　在大鼠系膜細(xì)胞模型中，VC提前給藥作用16h后顯著降低TGF-β1誘導(dǎo)的α-SMA

7、，F(xiàn)N和COL4的mRNA水平，并且減少了Smad2的磷酸化水平。VC激活A(yù)kt，使Ski穩(wěn)定性降低解除對(duì)Smad7的轉(zhuǎn)錄抑制，上調(diào)Smad7抑制TGF-β信號(hào)通路和細(xì)胞外基質(zhì)的累積。在Gulo-/-小鼠模型中，進(jìn)一步驗(yàn)證我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，剝奪VC顯著降低腎小球Smad7的表達(dá)，增加Ski的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　剝奪VC加重STZ誘導(dǎo)Gulo-/-小鼠的腎小球損傷;補(bǔ)充VC而不是VE，改善STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎小球纖維化;