糖尿病腎病腎小球硬化機(jī)制的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、目的：
　　 糖尿病腎?。―iabetic nephropathy，DN）是糖尿病常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥，它不僅是慢性腎功能衰竭患者腎移植的主要原因，還能大幅增加糖尿病患者心血管疾病的死亡率。腎小球硬化是1型與2型DN共同的特征性腎臟病理改變。DN發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，涉及氧化應(yīng)激、多元醇通路激活、糖基化終末產(chǎn)物沉積、血流動(dòng)力學(xué)改變及諸多細(xì)胞因子異常等因素，為了深入揭示DN腎小球硬化的病理機(jī)制，本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，以體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)

2、相結(jié)合，通過(guò)自發(fā)型2型DN模型OLETF大鼠腎皮質(zhì)胞漿和胞膜亞差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究和高糖環(huán)境下大鼠腎小球系膜細(xì)胞動(dòng)態(tài)差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究，探討DN時(shí)腎小球硬化發(fā)病過(guò)程中蛋白質(zhì)組學(xué)變化規(guī)律，以期更加深入理解DN腎小球硬化的發(fā)生機(jī)理。
　　 方法：
　　 1.自發(fā)型2型DN模型OLETF大鼠差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　 OLETF大鼠和遺傳背景相似但不發(fā)病的LETO大鼠各7只用于本實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中OLETF大鼠血糖及尿蛋白排泄呈

3、漸進(jìn)性升高，出現(xiàn)腎小球硬化及間質(zhì)纖維化等類(lèi)似于人類(lèi)2型DN的腎臟病理改變。動(dòng)物在36周齡時(shí)處死取材，分離腎皮質(zhì)，分別提取胞漿和胞膜總蛋白。獲得的蛋白樣品經(jīng)雙向電泳分離，膠體考馬斯亮藍(lán)染色顯示。掃描輸入計(jì)算機(jī)，用圖像分析軟件ImageMaster6.0對(duì)凝膠進(jìn)行分析，差異蛋白判定標(biāo)準(zhǔn)為：該蛋白點(diǎn)在LETO和OLETF兩組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（兩組蛋白點(diǎn)的volume％先經(jīng)方差不齊t檢驗(yàn)獲得p，后經(jīng)FDR校正后p<0.05），且volume％值變

4、化超過(guò)2倍。將凝膠中的差異蛋白點(diǎn)切出，經(jīng)膠內(nèi)胰蛋白酶解和MALDI-TOF-MS獲得肽質(zhì)量指紋譜并進(jìn)行Mascot對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。利用GoMinerTM、BINGO軟件對(duì)差異蛋白質(zhì)進(jìn)行Gene Ontologyq（GO）分類(lèi)和過(guò)度表達(dá)分析。對(duì)發(fā)現(xiàn)磷酸修飾的蛋白進(jìn)行進(jìn)一步的同源性和磷酸化位點(diǎn)保守性分析。
　　 2.高糖環(huán)境下大鼠腎小球系膜細(xì)胞動(dòng)態(tài)差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　 原代分離培養(yǎng)并傳至第5代的大鼠腎小球系膜細(xì)胞分別置

5、含5.5mM（正常對(duì)照組，NC組）和30mM葡萄糖（高糖組，HG組）培養(yǎng)基中，分別培養(yǎng)0h、8h、16h、72h、25day，提取細(xì)胞總蛋白。蛋白樣品經(jīng)雙向電泳技術(shù)分離，膠體考馬斯亮藍(lán)顯示，差異蛋白分析、判定，利用MALDI-TOF-MS獲得肽指紋圖譜進(jìn)行蛋白鑒定，對(duì)凝膠上多個(gè)蛋白點(diǎn)代表同一種蛋白質(zhì)的肽指紋圖譜進(jìn)行磷酸化修飾分析，對(duì)差異蛋白進(jìn)行GO功能分類(lèi)及過(guò)度表達(dá)分析。從IntAct Web Service Clien獲取差異蛋白質(zhì)的

6、相互作用網(wǎng)路，用Cytoscape顯示，并用MCODE分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.描述了36周齡OLETF和LETO大鼠腎皮質(zhì)胞漿和胞膜蛋白的差異蛋白質(zhì)組學(xué)變化。與LETO大鼠相比OLETF大鼠腎皮質(zhì)胞漿蛋白中9個(gè)蛋白點(diǎn)（Gapdh，Qdpr，F(xiàn)ah，similar to Protein C14orf159 mitochondrial precursor，Ephx2，Alb，Acadsb，Clyb1）下調(diào)，8個(gè)蛋白點(diǎn)

7、（Qdpr，Ephx2，F(xiàn)thfd，Tf，Naprt1，Idh1，F(xiàn)ah，Cryab）上調(diào)。胞膜蛋白中11個(gè)蛋白點(diǎn)（Uqcrfs1，Nm11，Pbld，LOC683519，Calb1，Acadsb，Dmgdh，Etfb）下調(diào)，10個(gè)蛋白點(diǎn)（LOC683519，Qdpr，GMPK，Etfb，Uqcrfs1，F(xiàn)ah，Dmgdh，Gpx3，eytokeratin8polypeptide）上調(diào)。這些差異蛋白主要定位在胞漿、線粒體和細(xì)胞小泡。能夠

8、和離子、維生素、蛋白結(jié)合，其分子功能主要和氧化還原活性、電子傳遞、轉(zhuǎn)運(yùn)、抗氧化有關(guān)，主要參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、應(yīng)激反應(yīng)和芳香族氨基酸、氧和活性氧代謝過(guò)程。其參與的生物學(xué)過(guò)程包括氧化還原、羧酸代謝、一元羧酸代謝、急性炎癥反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)、脂肪酸代謝過(guò)度表達(dá)等。研究中發(fā)現(xiàn)多個(gè)不同的點(diǎn)代表相同的蛋白質(zhì)，提示不同的轉(zhuǎn)錄版本或不同的翻譯后修飾在DN發(fā)病過(guò)程中有重要作用。初步判斷Odpr、Ephx2、LOC683519、GMPK在DN發(fā)病過(guò)程中

9、發(fā)生了磷酸化修飾的改變。Ephx2同源性較高，Thr-50、Thr-59、Ser-70在人、小鼠、大鼠中保守性較高。
　　 2.描述了高糖環(huán)境對(duì)腎小球系膜細(xì)胞影響的蛋白質(zhì)組學(xué)動(dòng)態(tài)變化。細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)28個(gè)差異蛋白點(diǎn)，其中在8h和16h2個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)上調(diào)（Rcn2，Hspb1），24個(gè)蛋白點(diǎn)（Tcp1，Wdr1，Cct2，Eno1，Adss，Eeflg，Idh1，Pebp1，Akrlb1，rCG53488，Pgam1，

10、Psma6，Psmb7，Prdx6，Gstp1，Stmn1，Sod1，Krt2-7，Hmgb1，Serpinb9）表達(dá)下調(diào)，72小時(shí)2個(gè)蛋白點(diǎn)（Psma6，Hmgb1）表達(dá)下調(diào)，25天有2個(gè)蛋白點(diǎn)（Pdia3，Idh3a）表達(dá)上調(diào)。差異表達(dá)的蛋白主要定位在胞漿、胞核、細(xì)胞骨架、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，能與蛋白、核酸、離子結(jié)合，其分子功能以抗氧化活性、氧化還原活性、水解酶活性、異構(gòu)酶活性為主；并參與細(xì)胞信號(hào)、細(xì)胞周期、凋亡、細(xì)胞增殖、細(xì)胞碳水化

11、合物代謝、DNA代謝、RNA代謝、蛋白質(zhì)代謝、氧和活性氧代謝等多種生物過(guò)程。GO過(guò)度表達(dá)和蛋白相互作用分析發(fā)現(xiàn)差異蛋白不僅和已知在DN發(fā)病中起到重要作用的糖代謝、氧化應(yīng)激、分子伴侶有關(guān)，還和蛋白酶體相關(guān)的蛋白降解過(guò)程密切相關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1.本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)與基因背景類(lèi)似的正常LETO大鼠相比糖尿病腎病大鼠OLETF大鼠中Qdpr、Ephx2、Fah、Fthfd、p55 protein等蛋白表達(dá)豐度或磷酸化修飾的

12、改變，尤其是發(fā)現(xiàn)體內(nèi)有著重要功能的Ephx2存在磷酸化修飾，且在糖尿病腎病下發(fā)生了磷酸化修飾的改變。提示在DN腎小球硬化過(guò)程中，許多蛋白不僅存在豐度變化，還存在轉(zhuǎn)錄后修飾變化。這些發(fā)現(xiàn)為DN腎小球硬化機(jī)理研究提供新的思路。
　　 2.本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境下系膜細(xì)胞PCBP1、HMGB1、Psma6、Psmb7、Prdx6、Rcn2、Serpinb9等蛋白表達(dá)豐度發(fā)生了動(dòng)態(tài)改變。通過(guò)信息生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)除了已知的通路外，蛋白酶體通