SIK1在糖尿病腎病大鼠腎小球早期病變中的作用及機制研究.pdf

1、【目的】
　　糖尿病腎病(DN)是糖尿病慢性并發(fā)癥之一,也是導(dǎo)致終末期腎病的一個主要原因,在腎小球發(fā)生的細胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)積聚等的纖維樣病變提示了糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展。在這一過程中,轉(zhuǎn)化生長因子β1(Transforminggrowthfactors-β1,TGF-β1)通過TGF-β1型受體即活化素受體樣激酶5(thetypeIactivinreceptor-likekinase(AL

2、K)5,ALK5)進行信號轉(zhuǎn)導(dǎo),進而進一步激活ECM的主要成分纖連蛋白(fibronectin,FN)和可以誘導(dǎo)ECM降解的纖溶酶原激活物抑制劑1(plasminogenactivatorinhibitortype1,PAI-1)的表達,導(dǎo)致ECM的積聚和降解的減少。研究表明選擇性抑制ALK5對與腎小球纖維化的這種慢性腎臟疾病是一種潛在治療方法。鹽誘導(dǎo)激酶1(SaltInducibleKinase1,SIK1)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,

3、SIK1可以與抑制型Smad7形成復(fù)合體并下調(diào)ALK5的表達而被認為是TGF-β的信號通路中的一個負向調(diào)控因子。雖然動物實驗發(fā)現(xiàn)SIK1在大鼠腎臟高表達,但SIK1在糖尿病腎臟中表達和腎小球纖維化病變之間的關(guān)系還未完全闡明,而高糖是否影響SIK1表達也鮮有報道。
　　因此,本研究應(yīng)用大鼠糖尿病模型和體外培養(yǎng)的大鼠腎系膜細胞,構(gòu)建鼠SIK1基因的真核表達載體,從整體、細胞和分子水平,系統(tǒng)研究了糖尿病腎臟及高糖環(huán)境中系膜細胞SIK1蛋

4、白表達情況及對ALK5信號通路的調(diào)控。
　　【方法】
　　1.SIK1在糖尿病腎病大鼠腎臟的表達和意義
　　將SPF級8周齡wistar大鼠隨機分為正常對照組(normal組,10只)和糖尿病組(diabetic組,20只)。糖尿病模型采用腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ,溶于pH值4.5的0.1mol/L枸櫞酸鹽緩沖液中,60mg/kg),對照組只注射相當(dāng)體積的枸櫞酸鹽緩沖液,72h后尾尖取血

5、,血糖≥16.7mmol/L者確定為1型糖尿病模型。于12和16周齡糖尿病模型組取5只大鼠,乙醚麻醉大鼠,眼球內(nèi)眥取血,離心分離血清,用于測定血糖;稱重后于腹腔注射65mg/kg戊巴比妥鈉麻醉,分離腎臟。于20周齡,將各組大鼠于代謝籠中,監(jiān)測24h尿量,尿白蛋白及尿肌酐(Ucr)水平,并計算內(nèi)生肌酐清除率(Ccr)和尿白蛋白排泄率(UAER)。麻醉取血,分離血清測定血糖,血肌酐及尿素氮水平。摘取腎臟,稱重,計算腎臟指數(shù)。取部分腎組織置于

6、4％多聚甲醛固定,用于HE,PAS染色觀察其病理變化情況。
　　取腎組織制備切片進行免疫組化。分別提取腎組織及腎小球組織蛋白,應(yīng)用免疫沉淀及Westernblot方法以及觀察糖尿病大鼠腎臟SIK1蛋白表達及磷酸化水平的影響。并應(yīng)用Westernblot方法觀察20周齡大鼠腎小球ALK5、FN、PAI-1表達情況,Masson染色觀察20周齡大鼠腎小球膠原纖維及ECM聚集情況。
　　2.高糖刺激對系膜細胞SIK1的表達、活性、

7、細胞內(nèi)分布及ALK5信號通路的影響,SIK1表達質(zhì)粒對高糖刺激下的系膜細胞ALK5信號通路及系膜細胞增殖的影響
　　大鼠腎系膜細胞HBZY-1細胞以含有10%胎牛血清、100KU/L青霉素及100mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),用高糖(30mmol/L,Highglucose,HG)制備模型,于刺激后0、12、24和48h收集細胞,免疫沉淀、Westernblot及半定量RT-PCR分別檢測SIK1表達及磷酸化水平。構(gòu)建pEG

8、FP-SIK1表達質(zhì)粒,激光共聚焦觀察高糖刺激下細胞內(nèi)生性及轉(zhuǎn)染pEGFP空質(zhì)粒及pEGFP-SIK1表達質(zhì)粒后SIK1細胞內(nèi)分布及核轉(zhuǎn)運情況。Westernblot及免疫細胞化學(xué)觀察高糖對HBZY-1細胞ALK5信號通路的影響。
　　設(shè)計和構(gòu)建針對SIK1基因的表達質(zhì)粒,將對數(shù)生長期細胞接種于6孔培養(yǎng)板中,同步化后將細胞隨機分為3組,空白細胞對照組、pCDF1空質(zhì)粒對照組和pCDF1-SIK1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組,24h后細胞長至70-8

9、0%時開始轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染采用陽離子脂質(zhì)體法。48h后熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率,終止培養(yǎng)進行蛋白、RNA提取。Westernblot及半定量RT-PCR檢測細胞內(nèi)SIK-1蛋白和mRNA的表達。對各組轉(zhuǎn)染成功細胞以高糖繼續(xù)培養(yǎng)48h,終止培養(yǎng)后以Westernblot及細胞免疫組化檢測SIK1、ALK5、FN及PAI-1表達,MTT法檢測細胞增殖情況。
　　【結(jié)果】
　　1.SIK1在糖尿病腎病大鼠腎臟的表達和意義
　　(1)

10、wistar大鼠腹腔注射STZ成功建立1型糖尿病模型。與正常對照組比較,模型組表現(xiàn)出多飲、多食及體重減輕的特點。20周齡時,模型組餐后血糖水平升高,但血甘油三酯及膽固醇水平正常。與正常對照組相比,模型組出現(xiàn)糖尿病腎病的明顯特征,各腎功能指標均表現(xiàn)出顯著性差異。糖尿病模型組24h尿量、腎體重比、尿白蛋白分泌率、血肌酐,肌酐清除率,血尿素氮指標水平均明顯升高,并出現(xiàn)腎小球肥大、纖維化,基底膜增厚等病理改變,腎小球面積及系膜增殖指數(shù)明顯增大。

11、
　　(2)免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn),SIK1在正常大鼠腎臟的腎小球及遠曲小管表達明顯,在近曲小管表達較少,且在各細胞的胞漿無著色,胞核無著色。在糖尿病模型組大鼠中,SIK1在腎小管的表達與正常對照組一致。而在腎小球的隨病程月數(shù)的增加,SIK1的表達依次減少,呈時間依賴性。Westernblot檢測發(fā)現(xiàn),在糖尿病大鼠腎組織SIK1的表達在三個時間點無明顯變化,與正常對照組大鼠20周齡一致。而腎組織SIK1磷酸化水平在三個時間點卻依次減

12、少,且均明顯低于正常對照組大鼠20周齡腎組織SIK1磷酸化水平。分離腎小球提取蛋白發(fā)現(xiàn),糖尿病大鼠腎小球SIK1的表達在三個時間點表達卻依次減少,均明顯低于正常對照組大鼠20周齡腎小球SIK1的表達。
　　(3)與正常對照組大鼠相比,Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)20周齡糖尿病大鼠腎小球ALK5、FN、PAI-1表達明顯增高,Masson染色觀察發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠腎小球腎小球膠原纖維及ECM明顯聚集。
　　2.高糖刺激對系膜細胞

13、SIK1的表達、活性、細胞內(nèi)分布及ALK5信號通路的影響,SIK1表達質(zhì)粒對高糖刺激下的系膜細胞ALK5信號通路及系膜細胞增殖的影響
　　(1)高糖刺激后0、12、24、48h,經(jīng)免疫沉淀及Westernblot檢測發(fā)現(xiàn),SIK1的表達及磷酸化水平依次遞減,呈時間依賴性,有統(tǒng)計學(xué)意義。細胞免疫熒光后激光共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)SIK1在HBZY-1細胞的核內(nèi)外均勻表達,高糖刺激下表達減少并向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運。轉(zhuǎn)染pEGFP-SIK1表達質(zhì)粒后,激

14、光共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)GFP熒光信號在高糖刺激下由核外向核內(nèi)轉(zhuǎn)移。
　　(2)高糖刺激后0、12、24、48h,經(jīng)Westernblot檢測發(fā)現(xiàn),ALK5、FN、PAI-1表達水平依次遞增,呈時間依賴性,有統(tǒng)計學(xué)意義。相對于高糖刺激后0h,細胞免疫組化發(fā)現(xiàn)在高糖刺激48h后FN、PAI-1表達水平明顯增高。
　　(3)經(jīng)酶切鑒定和測序分析,質(zhì)粒符合設(shè)計要求,命名為pCDF1-SIK1。轉(zhuǎn)染HBZY-1細胞24h后熒光倒置顯微鏡可見

15、綠色熒光蛋白表達,48h表達量達60%以上。相對于正常對照組及pCDF1空質(zhì)粒對照組,半定量RT-PCR及Westernblot檢測提示pCDF1-SIK組mRNA水平分別增加1.81和1.86倍,蛋白水平分別增加1.81和2.06,繼續(xù)高糖刺激48h后,Westernblot檢測提示pCDF1-SIK組ALK5蛋白水平降低37.5%和39%,FN、PAI-1表達水平亦明顯下降,并且MTT檢測提示pCDF1-SIK可明顯抑制高糖對HBZ

16、Y-1細胞的增殖作用。
　　【結(jié)論】
　　(1)Wistar鼠腹腔注射STZ建立的1型糖尿病模型,在20周齡時出現(xiàn)糖尿病腎病的明顯特征有,明顯的ECM聚集;(2)SIK1主要在正常大鼠腎臟的遠曲小管和腎小球表達明顯,在近曲小管表達較少。隨著糖尿病病程進展,腎臟SIK1表達無明顯變化,但腎臟SIK1磷酸化水平及腎小球SIK1的表達逐漸減少。而在20周齡時腎小球ALK5,FN及PAI-1表達明顯,提示SIK1在腎小球表達減少可能

17、參與腎小球纖維化早期病變的發(fā)生和發(fā)展;(3)在細胞模型上,高糖可抑制SIK1的182位點磷酸化水平及表達水平,導(dǎo)致SIK1向細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)運。同時高糖激活A(yù)LK5信號通路,提示SIK1的182位點磷酸化的抑制是高糖下調(diào)SIK1的主要原因,受抑制的SIK1可能導(dǎo)致ALK5信號通路的激活,進而導(dǎo)致細胞內(nèi)的ECM聚集和細胞增殖。(4)重組質(zhì)粒pCDF1-SIK能夠激活體外培養(yǎng)的大鼠系膜細胞SIK1蛋白表達,下調(diào)ALK5信號通路,減少細胞內(nèi)ECM聚