人2型糖尿病紅細胞膜的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、糖尿病是對現(xiàn)代人健康威脅最大的疾病之一。對糖尿病多年的研究取得了一些成果，但仍然有許多未解決的問題，糖尿病的發(fā)病機理、對患者機體的損傷機制、高血糖對患者的病理影響、胰島素抵抗的機制都沒有完全明了，也沒有找到較好的根治方法。在糖尿病患者中，血液是病理作用的重要靶組織，患者血液長期處于高血糖、胰島素分泌紊亂等特征病理條件下，這很可能引起紅細胞膜蛋白的損傷或改變。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，及其在疾病研究中的應(yīng)用，越來越多的研究者利用蛋白質(zhì)組學(xué)

2、的分析方法，來探索各種人類疾病的分子機制；尋找引起疾病的關(guān)鍵蛋白質(zhì)；篩選對疾病的診斷、治療、預(yù)后和新藥開發(fā)都有重要意義的標(biāo)記分子。為了探索2型糖尿病病變機制，結(jié)合本實驗室在蛋白質(zhì)組學(xué)方面已經(jīng)開展的工作和實驗條件，本文從比較蛋白質(zhì)組學(xué)的角度，比較正常人和糖尿病人紅細胞膜蛋白及膜Lipidrafts蛋白的表達變化情況，以期找到在糖尿病患病過程中起關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)，為糖尿病臨床診斷、治療和預(yù)后檢測提供可利用的分子標(biāo)記，并在此基礎(chǔ)上進一步探討糖

3、尿病的病變機制。 用2DE/MS方法進行紅細胞膜蛋白質(zhì)組學(xué)分析，首要要解決的關(guān)鍵是高效和高質(zhì)量的膜蛋白的分離，我們在整個實驗中，選擇了多種去垢劑，嘗試不同的配方來提取完整的紅細胞膜蛋白質(zhì)，經(jīng)過對比及抽提方法和上樣、聚焦條件的優(yōu)化，選擇0.5﹪ASB14,5M尿素，2M硫脲，50mMDTT作為膜蛋白的溶解液；使用了17cm的非線性預(yù)制膠條，等電聚焦60，000vhr；得到重復(fù)性較好，分辨率較高—分離得到600個左右的蛋白質(zhì)點的二維

4、電泳圖譜。利用PD-Quest軟件分析比較正常人和糖尿病人紅細胞膜蛋白二維電泳圖譜的差異，發(fā)現(xiàn)表達水平有顯著性差異(P＜0.05)的蛋白質(zhì)42個，其中27個蛋白質(zhì)點的表達在糖尿病人中升高，15個則降低。對這些候選蛋白質(zhì)進行選擇，取3個蛋白質(zhì)點進行基質(zhì)輔助激光解析電離—飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF)分析，得到蛋白質(zhì)的肽指紋圖譜，并在網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫進行搜索，鑒定得到了這些蛋白質(zhì)分別是：Syntaxin1C；Flotillin-1；Argin

5、ase1。 對這些在糖尿病人紅細胞膜上發(fā)生差異的蛋白質(zhì)進行分析。Syntaxin1在細胞中與囊泡和質(zhì)膜的融合有關(guān)，細胞中GLUT4轉(zhuǎn)運到質(zhì)膜上在肌肉和脂肪細胞中主要是依靠囊泡的運輸、搭靠和膜的融合，將葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4(GLUT4，Glucosetransporter4)分子固定在細胞膜上，從而發(fā)揮轉(zhuǎn)運葡萄糖及其它糖類的功能；Flotillin-1存在與脂筏上，往往和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子關(guān)聯(lián)，預(yù)示著它在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著一定作用，肌肉和脂肪組

6、織中新的胰島素依賴型的葡萄糖代謝信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，該通路不依賴于PI(3)K(Phosphatidylinositol-3-OHkinase)，當(dāng)胰島素和其受體結(jié)合后，通過級聯(lián)反應(yīng)，激活CAP(Cbi-associatedprotein)，但只有當(dāng)CAP蛋白和Flotillin-1結(jié)合并轉(zhuǎn)移到細胞膜的特定區(qū)域時，才能與Cbl結(jié)合并激活下游反應(yīng)，最終GLUT4通過胞吐作用與質(zhì)膜融合并參與葡萄糖運輸；Arginase1可通過與一氧化氮合成酶(N

7、OS)競爭底物—L-精氨酸使后者生成尿素和L-鳥氨酸，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)NO的生成，一氧化氮(NO)是種具有多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的獨特分子，NO表達異常和多種疾病相關(guān)，如糖尿病、動脈硬化和高血壓等。 為深入研究Flotillin-1，Arginase1在糖尿病中的機制，我們克隆表達純化了Flotillin-1，同源蛋白Flotillin-2，Arginase1，及其它紅細胞膜蛋白，葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1(GLUT1，Glucosetranspor

8、ter1)片斷，利用蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用的方法，研究它們之間的相互作用。使用Far-Western和Pull-downassay方法驗證了Flotillin-1和Flotillin-2，F(xiàn)lotillin-1和Arginase1存在著直接相互作用。我們觀察到除了Cdb3外，紅細胞膜上還存在另一條途徑將膜和細質(zhì)相互偶聯(lián)，即膜上的Flotillin-1能將水溶性的Arginase1帶到膜上，并且由此調(diào)節(jié)后者的活性。同時為了研究它們在細胞內(nèi)

9、的功能，我們初步嘗試在真核體系表達Flotillin蛋白，驗證方案的可行性，接著研究蛋白的共定位及性質(zhì)和功能，對進一步闡明Flotillin-1和Arginase1在糖尿病人紅細胞膜上變化機制奠定了基礎(chǔ)。 脂筏上包含有許多蛋白質(zhì)，特別是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，使脂筏具有許多功能：參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和參與細胞蛋白的運轉(zhuǎn)。我們發(fā)現(xiàn)在糖尿病人表達量明顯上升的Flotillin-1分布在脂筏上，且葡GLUTl也分布在脂筏上，在糖尿病人中運輸功能也發(fā)生了