ADAM33表達(dá)調(diào)控對(duì)氣道平滑肌力學(xué)行為影響及其機(jī)理研究.pdf

1、哮喘是常見的慢性呼吸道疾病之一，其機(jī)理的揭示仍然是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的難題。哮喘的特征是氣道重構(gòu)以及氣道平滑肌會(huì)發(fā)生過度收縮反應(yīng)（AHR）。近年來研究發(fā)現(xiàn)哮喘也是和遺傳相關(guān)的疾病，ADAM33基因被證實(shí)是哮喘的易感基因，在大部分哮喘患者的氣道平滑肌和基底膜上表達(dá)較健康對(duì)照顯著增高。諸多臨床證據(jù)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ADAM33基因過表達(dá)與氣道重塑以及氣道高反應(yīng)性的產(chǎn)生存在重要關(guān)聯(lián)，而且這種關(guān)聯(lián)很可能是直接通過氣道平滑肌力學(xué)行為聯(lián)系起來的。然而至今沒有

2、證據(jù)闡明氣道平滑肌細(xì)胞生物力學(xué)行為與其ADAM33表達(dá)之間的關(guān)系。因此，我們推測ADAM33的過量表達(dá)能夠通過影響氣道平滑肌的力學(xué)及生物學(xué)行為來促進(jìn)氣道重構(gòu)以及AHR的發(fā)生發(fā)展過程。
　　我們前期研究發(fā)現(xiàn) sADAM33超表達(dá)能夠引起氣道平滑肌基礎(chǔ)剛度以及收縮能力的顯著提升，并且能夠增加平滑肌在的二維基底的劃痕側(cè)向遷移能力，降低其在 Transwell中跨微孔的遷移能力，證實(shí)了 ADAM33的表達(dá)確實(shí)會(huì)影響氣道平滑肌的力學(xué)行為，但

3、其機(jī)理并不清楚，而且ADAM33超表達(dá)對(duì)氣道平滑肌其他重要力學(xué)行為如對(duì)周期性應(yīng)變、短暫拉伸響應(yīng)、遷移行為和粘附能力的影響還未知。因此本研究就ADAM33超表達(dá)對(duì)氣道平滑肌收縮能力、短暫拉伸響應(yīng)、粘附能力和遷移行為等力學(xué)行為的影響進(jìn)行了進(jìn)一步研究，并對(duì)其機(jī)理進(jìn)行了初步探索，這對(duì)解釋哮喘發(fā)病機(jī)理以及研究有效治療手段提供了有利參考。
　　主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　1）初步探索ADAM33表達(dá)影響ASMCs基礎(chǔ)剛度、收縮能力的機(jī)

4、制。
　　脫血清培養(yǎng)48 h后sADAM33超表達(dá)顯著上調(diào)了α-actin、calponin、SM-MHC這三種收縮態(tài)標(biāo)志蛋白mRNA以及蛋白表達(dá)水平。進(jìn)一步對(duì)ASMCs的Rho活性進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)sADAM33超表達(dá)導(dǎo)致pLV-ADAM33組的Rho-GTP占總Rho的比例比GFP組高一倍左右。當(dāng)在培養(yǎng)基中加入ROCK抑制劑后發(fā)現(xiàn)sADAM33超標(biāo)達(dá)所導(dǎo)致的這些調(diào)控幾乎都被完全抑制了。這些研究結(jié)果表明 sADAM33超表達(dá)會(huì)引起A

5、SMCs收縮蛋白的過度積累而導(dǎo)致其處于超強(qiáng)收縮態(tài)，這一調(diào)控過程很大程度上依賴于Rho/ROCK信號(hào)通路介導(dǎo)。另外，我們發(fā)現(xiàn)sADAM33超表達(dá)的ASMCs細(xì)胞的培養(yǎng)基中的sADAM33濃度顯著升高，將該條件培養(yǎng)基用于培養(yǎng)對(duì)照組平滑肌后發(fā)現(xiàn)能引起其收縮蛋白表達(dá)量的增高，從而確認(rèn) sADAM33可以作為可溶蛋白發(fā)揮作用。
　　2）ADAM33調(diào)控對(duì)ASMCs響應(yīng)長期小幅拉伸及大幅短暫拉伸的影響并驗(yàn)證ADAM33是否是力敏感基因。

6、>　　經(jīng)過48 h、0.3Hz、5％的單軸拉伸后，sADAM33超表達(dá)會(huì)與周期性單軸應(yīng)變加載產(chǎn)生協(xié)同作用而上調(diào)平滑肌收縮蛋白表達(dá)，特別是SM-MHC的表達(dá)。我們推測 sADAM33超表達(dá)在哮喘患者氣道周期性單軸應(yīng)變的情況下，有可能更加促進(jìn)平滑肌細(xì)胞肌球蛋白的表達(dá)以及肌球蛋白纖維的組裝。促進(jìn)較長的肌球蛋白纖維的形成，進(jìn)而產(chǎn)生較大而且穩(wěn)定的被動(dòng)收縮，導(dǎo)致氣道平滑肌變成收縮力更強(qiáng)緊張度更高的超強(qiáng)收縮態(tài)，從而促進(jìn)AHR的產(chǎn)生。另外對(duì)周期拉伸狀態(tài)

7、下平滑肌的ADAM33表達(dá)的檢測表明，ADAM33并不是一個(gè)嚴(yán)格的力敏感基因，對(duì)于周期性單軸應(yīng)力刺激只在早期（24 h）有一定響應(yīng)。
　　經(jīng)過4 s、10%的短暫大幅拉伸后的瞬間，sADAM33超表達(dá)的細(xì)胞牽引力顯著高于陰性對(duì)照和ADAM33沉默的細(xì)胞，并且在整個(gè)恢復(fù)過程中都比另外兩組細(xì)胞的牽引力要高，因此 sADAM33超表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞在面臨深呼吸帶來的10%左右大幅拉伸時(shí)細(xì)胞軟化程度遠(yuǎn)不如正常的平滑肌細(xì)胞，而且再硬化

8、的速度也會(huì)大大加快。這就可能導(dǎo)致深呼吸軟化氣道平滑肌的作用被嚴(yán)重減弱，與哮喘患者氣道中觀察到的現(xiàn)象相一致。
　　綜合這兩個(gè)模擬周期性呼吸和深呼吸的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為 sADAM33超表會(huì)顯著促進(jìn)氣道重構(gòu)后的平滑肌表型轉(zhuǎn)變成為更強(qiáng)的收縮態(tài)擁有更強(qiáng)的收縮能力從而促進(jìn)AHR的發(fā)生，對(duì)深呼吸時(shí)氣道擴(kuò)張帶來的平滑肌軟化有較強(qiáng)的削弱作用。
　　3）ADAM33調(diào)控對(duì)ASMCs遷移以及粘附行為的影響。
　　劃痕遷移時(shí) sADAM33

9、超表達(dá)并沒有顯著改變 ASMCs遷移凈距離和遷移速率，但是顯著上調(diào)了其遷移效率和遷移方向角的集中程度。sADAM33超表達(dá)所導(dǎo)致的平滑肌劃痕遷移能力增強(qiáng)，很可能并不是通過增加平滑肌遷移速率來實(shí)現(xiàn)的。而可能是通過增加細(xì)胞之間緊密連接從而更傾向于與周圍細(xì)胞一起運(yùn)動(dòng)，呈現(xiàn)群體遷移的特征并增加遷移方向穩(wěn)定性來實(shí)現(xiàn)的。單細(xì)胞遷移的數(shù)據(jù)也很好地支持了這一猜想，因?yàn)?sADAM33超表達(dá)反而是降低了單細(xì)胞遷移凈距離和遷移速率的?？赡苁且?yàn)?sADAM

10、33超表達(dá)使平滑肌轉(zhuǎn)變成超強(qiáng)收縮態(tài)，細(xì)胞剛度變大形變能力減弱更具惰性，導(dǎo)致前期研究中發(fā)現(xiàn)的跨膜遷移能力降低。
　　以上研究結(jié)果一方面對(duì)于我們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)ADAM33在哮喘氣道重構(gòu)和高反應(yīng)性中所起作用，并解釋前期研究結(jié)果的矛盾具有重要的意義；本研究不僅在國際上首次揭示了ADAM33過表達(dá)與氣道高反應(yīng)及氣道重構(gòu)相關(guān)性的初步機(jī)理，而且對(duì)于更好地理解ADAM33基因多態(tài)性和哮喘易感這一僅停留在基因?qū)用嫔系默F(xiàn)象提供了和細(xì)胞功能相關(guān)的線索，為將