ADAM33表達量與氣道平滑肌細胞生物力學屬性的關(guān)系研究.pdf

1、哮喘(Asthma)是一種常見的慢性呼吸道系統(tǒng)疾病，涉及環(huán)境因素與遺傳因素之間的復(fù)雜相互作用，是公認的醫(yī)學難題，嚴重威脅著人類的生命健康。然而其生理病理機制至今還沒有得到完全地解釋。有研究表明，哮喘的病理機制中包括氣道重塑(airway remodeling)，氣道炎癥(Airway inflammation)以及氣道高反應(yīng)性(Airway hyperresponsiveness，AHR)等。目前國際上公認的哮喘可能的發(fā)病機制是，氣道平

2、滑肌細胞(Airway smooth muscle cell,ASMC)自身生物力學屬性發(fā)生改變，當受到外界理化因素刺激時，其反應(yīng)性增強導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性與氣道狹窄以及隨之而來的呼吸功能障礙。因此氣道平滑肌生物力學屬性變異作為此途徑的終極因素成為研究哮喘生理病理機制的重點。
　　近年來，通過定位克隆和全基因組篩查技術(shù)確定了去整合素堿金屬蛋白酶33(A disintegrin and metalloproteinase 33,ADAM

3、33)是一種哮喘易感基因，且發(fā)現(xiàn)ADAM33基因與哮喘疾病特征的氣道炎癥和組織重構(gòu)具有一定聯(lián)系。然而與氣道炎癥同等重要的哮喘氣道病理變化是源于ASMC生物力學屬性改變所導(dǎo)致的AHR，且已有研究表明ADAM33在哮喘患者氣道組織的間充質(zhì)層包括成纖維層、基底膜和平滑肌層上的表達水平比正常人高。由此認為在哮喘發(fā)生發(fā)展過程中ASMC的ADAM33蛋白表達與ASMC生物力學屬性是否具有一定的相關(guān)性、以及ADAM33蛋白的表達是否參與調(diào)控ASMC力

4、學特性。為了解決這個問題，本課題采用卵清蛋白(OVA)致敏新生雄性SD大鼠構(gòu)建哮喘動物模型，在此基礎(chǔ)上分離純化ASMC在體外進行原代培養(yǎng)，研究哮喘病理氣道中ASMC的ADAM33蛋白表達水平，及其與ASMC生物力學行為之間的相關(guān)性，同時檢測在體外調(diào)控ADAM33蛋白表達后ASMC細胞生物力學行為的響應(yīng)，研究兩者之間的關(guān)系。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　①研究了不同程度OVA致敏雄性SD大鼠哮喘模型ASMC的ADAM33蛋白表達水平

5、。首先將新生雄性SD大鼠隨機分為4組，哮喘組在第1和第7天時注射含1％OVA和10%Al(OH)3的混合鹽溶液，第15天起用1%OVA每周霧化3次，分別持續(xù)4、6和12周以建立不同程度慢性O(shè)VA致敏動物，正常對照組動物用相同的實驗方案采取同等劑量的生理鹽水處理。從動物模型中分離、獲取ASMC并在體外進行原代培養(yǎng)，細胞傳代至2-5代用于各項實驗。當細胞長至90%融合時，提取總蛋白，將等體積的蛋白溶液加入到10%SDS-PAGE膠中，隨后用

6、免疫印記方法(western blot)檢測細胞中ADAM33蛋白表達水平，實驗結(jié)果表明OVA致敏組ASMC中ADAM33蛋白表達水平顯著高于對照組(p<0.001)，增加水平在OVA致敏4周時達到最大，致敏6和12周表達水平漸次。
　?、谘芯苛苏ＥcOVA致敏來源的ASMC生物力學屬性。從氣道的功能來看，ASMC的力學屬性被認為是決定哮喘病癥之一氣道高反應(yīng)的最終途徑。因此本研究綜合采取光學磁粒扭轉(zhuǎn)細胞測量儀(Optical Ma

7、gnetic Twisting Cytometry,OMTC)、傅立葉變換牽引力顯微術(shù)(Fourier Transform Traction Microscopy,FTTM)、Transwell小室法以及免疫熒光染色技術(shù)檢測包括細胞剛度和收縮性、細胞牽引力、細胞遷移以及細胞骨架結(jié)構(gòu)蛋白表達在內(nèi)的細胞力學屬性。實驗結(jié)果表明，與對照組相比OVA致敏組ASMC細胞剛度增加，致敏4周時具有顯著性差異(p<0.05)，隨后漸次，然而各組細胞對KC

8、l激動劑的響應(yīng)沒有顯著性差異。同樣，OVA致敏組中ASMC牽引力提高，尤其在OVA致敏4周時具有顯著性差異(p<0.05)，隨后隨著致敏時間的增加有所降低。OVA致敏組ASMC的遷移能力增加，同樣的致敏4周時達到最大具有顯著性差異(p<0.001)。致敏組ASMC中包括F-actin和Vinculin的細胞骨架結(jié)構(gòu)蛋白的表達較對照組有所提高，特別是致敏4周時，Vinculin的表達具有顯著性差異（p<0.001）。
　?、鄯治隽薃

9、DAM33蛋白表達水平與ASMC力學屬性之間的相關(guān)性。實驗結(jié)果表明，ASMC的ADAM33蛋白表達的變化和ASMC力學屬性的改變對OVA致敏具有相同的響應(yīng)趨勢，暗示兩者之間似乎具有一定的相關(guān)性。通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)ASMC中ADAM33蛋白的表達水平與細胞剛度、細胞牽引力、細胞遷移以及包括F-actin和Vinculin的細胞骨架結(jié)構(gòu)蛋白表達在內(nèi)的細胞力學屬性具有很強的正相關(guān)性(Pearson相關(guān)系數(shù)Cp：分別是0.864，0.716，0

10、.67，0.662，0.774，如表3.1所示)。
　　④研究了調(diào)控ADAM33蛋白表達后ASMC細胞力學屬性的響應(yīng)。用上述實驗中發(fā)現(xiàn)的蛋白表達與力學屬性改變最大的OVA致敏4周的ASMC，通過慢病毒轉(zhuǎn)染的辦法構(gòu)建沉默ADAM33蛋白表達的ASMC組，然后檢測細胞的力學屬性響應(yīng)。我們的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)與無處理對照組(4weeks)以及慢病毒轉(zhuǎn)染對照組(GFP)相比，沉默組(pLVT453)細胞的剛度與細胞牽引力都顯著下降(p<0.05