哮喘易感基因ADAM33對氣道平滑肌細胞力學行為的影響.pdf

1、哮喘病是一種常見的呼吸道慢性炎癥疾病，是指支氣管在高反應狀態(tài)下，由變應原或其他因素引起的氣道狹窄的疾病，主要癥狀有胸悶、咳嗽、呼吸困難等。氣道平滑肌細胞﹙Airway Smooth Muscle Cell，ASMC﹚是呼吸道的主要組成部分之一，具有重要的生理作用。當氣道平滑肌在受到外來因子的刺激時會發(fā)生氣道過度收縮反應（Airway hyperrespinsiveness，AHR），臨床表現(xiàn)為患者氣道過度縮窄和發(fā)作性呼吸障礙，這是導致哮

2、喘病成為高危疾病的最終原因所在。雖然在哮喘病的研究當中，對ASMC收縮特性的認識已經(jīng)有一個多世紀，但是關于氣道平滑肌病理變化的機制卻沒有研究透徹。氣道平滑肌是控制氣管管徑的效應器，其病理性收縮成為氣道阻塞和呼吸困難的最終因素，它在決定哮喘病治療方法的有效性方面起到關鍵的作用，普遍認為其病理性收縮是哮喘難治的重要的病理基礎。去整合素堿金屬蛋白酶33（A disintegrin and metalloprotease33，ADAM33）基因

3、已被證實是一個哮喘易感基因，且在大部分哮喘患者的氣道平滑肌和基底膜上其表達水平較健康受試者要高，說明 ADAM33可能參與 ASMC力學環(huán)境的調(diào)控，進而與哮喘病人ASMC力學特性異常及氣道重構(gòu)有關。然而，至今還沒有直接的證據(jù)證明 ASMC生物力學行為與其 ADAM33表達之間的關系。因此，本文采用分子生物學方法調(diào)控 ASMC的ADAM33表達，同時采用細胞生物力學方法測量超表達和沉默 ADAM33的ASMC的力學行為，以揭示二者之間的直

4、接關系。本文的主要研究內(nèi)容和研究結(jié)果如下：
　?、貯DAM33的表達水平隨著SD大鼠霧化周數(shù)的增加而顯著性升高。首先，利用氫氧化鋁作為佐劑，卵清蛋白（OVA）致敏并激發(fā)哮喘，建立 SD(Sprague Dawley)大鼠哮喘模型。每周隔天OVA霧化3次，每次30分鐘，共霧化12周，每2周取大鼠肺組織。通過對肺功能(Penh）的測定及氣道組織 HE(Hematoxylin-Eosin staining)染色觀察結(jié)果表明我們已成功構(gòu)建

5、大鼠哮喘模型。接著，利用定量RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測ADAM33在OVA霧化不同周數(shù)的SD大鼠哮喘平滑肌細胞中的表達，結(jié)果顯示 ADAM33的表達水平隨著 OVA霧化周數(shù)的增加而顯著性升高，且定量RT-PCR與Western blot的實驗結(jié)果基本一致。從而說明ADAM33的表達水平與哮喘的嚴重程度呈正相關，該結(jié)果與Lee等在哮喘病人中的研究發(fā)現(xiàn)相符合，更近一步證明我們實驗中所構(gòu)建的SD大鼠哮喘模型能真實地模擬哮喘

6、病。
　?、讷@得ADAM33超表達和沉默的ASMC。首先，構(gòu)建ADAM33基因超表達和干擾慢病毒重組載體，然后進行慢病毒轉(zhuǎn)染，以GFP空載及未轉(zhuǎn)染細胞作為對照。在熒光顯微鏡下觀察到重組慢病毒轉(zhuǎn)染正常SD大鼠ASMC，24h后GFP表達逐漸增強，至培養(yǎng)72h時GFP表達最強到高峰，并發(fā)現(xiàn)當MOI(Multiplicity of Infection)=100時，慢病毒感染ASMC的效率為95％。定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示，超表達組

7、ADAM33基因表達水平是正常對照組的8倍（P＜0.01），沉默組中pLVT453沉默效率最高達到75%（P＜0.01）；同時，Western blot測定各組細胞的ADAM33蛋白表達水平結(jié)果表明，超表達組細胞內(nèi) ADAM33蛋白表達較兩組對照明顯增高（P＜0.01），而沉默組表達明顯降低（P＜0.01），ADAM33蛋白在兩組對照組中的表達量無明顯差別。本實驗成功獲得了穩(wěn)定的ADAM33超表達和沉默ASMC，且重組慢病毒轉(zhuǎn)染明顯上調(diào)

8、或抑制了ASMC中ADAM33基因mRNA和蛋白的表達。
　?、跘DAM33基因表達水平的變化改變了ASMC的遷移能力和增殖能力。采用MTT法觀察不同4組細胞增殖情況，發(fā)現(xiàn)超表達組pLV-ADAM33的細胞增殖能力與空白對照組相比沒有顯著性差異；而沉默組pMa-ADAM33相對于對空白照組細胞增殖能力明顯降低（P＜0.05）。GFP對照組的細胞增殖能力顯著低于未轉(zhuǎn)染對照組（P＜0.01），由此我們可以看出慢病毒轉(zhuǎn)染對細胞增殖能力有

9、抑制作用，雖然上調(diào)ADAM33對細胞增殖能力對于未轉(zhuǎn)染對照組來說無差異，但是相對GFP對照組的細胞增殖能力顯著增強（P＜0.01）。劃痕法(Wound healing)檢測細胞橫向遷移能力的結(jié)果顯示，在12h時，4組細胞遷移無明顯差異。但是在24h時，超表達組pLV-ADAM33的橫向遷移能力與兩組對照相比明顯增強（P＜0.01）（P＜0.05）；而沉默組pMa-ADAM33的細胞顯著降低（P＜0.01），該結(jié)果表明通過特異性改變ADA

10、M33基因的表達，能夠影響ASMC橫向遷移能力。
　　④ADAM33基因能調(diào)控 ASMC的細胞基礎剛度、收縮力及牽張力等細胞力學特性。運用光學捕捉（Optical trapping）與磁力扭轉(zhuǎn)細胞測量術(shù)（Magnetic Twisting Cytometry）和傅里葉變換牽引力顯微術(shù)（Fourier Transform Traction Microscopy，F(xiàn)TTM）檢測由慢病毒轉(zhuǎn)染所獲得的穩(wěn)定超表達和干擾ADAM33的ASMC

11、的生物力學特性。研究結(jié)果顯示：1)超表達ADAM33的ASMC組pLV-ADAM33的細胞基礎剛度、KCL激動劑處理后的收縮力、牽張力顯著高于對照組，而 ADAM33沉默的細胞組其上述參數(shù)明顯低于對照。2)共聚焦免疫熒光結(jié)果顯示 ADAM33和黏著斑蛋白vinculin存在共定位關系，并且還有部分ADAM33有沿著應力纖維分布的情況，說明ADAM33可能調(diào)控細胞骨架結(jié)構(gòu)和粘著斑的形成。3)通過定量RT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ADMA33基

12、因表達水平的改變能調(diào)控細胞力學相關基因Calponin和Integrin-β1的表達。
　　從以上實驗結(jié)果，我們推測：調(diào)控ADAM33的表達直接影響到ASMCs的生物力學行為，提示ASMCs的生物力學行為與其ADAM33的表達存在直接的聯(lián)系。因此，哮喘患者中ADAM33基因表達及修復的異常有可能在氣道重塑和氣道收縮高反應性等方面扮演決定性的角色，這對于深入理解哮喘的發(fā)病機制，特別是氣道功能變換的內(nèi)在調(diào)控機制，從而探尋有效的哮喘治療