模擬病理狀態(tài)下氣道上皮組織對(duì)氣道平滑肌增生的影響研究.pdf

1、哮喘(Asthma)作為一種慢性呼吸道疾病，正日益成為嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的重大問(wèn)題。令人遺憾的是，科學(xué)界對(duì)哮喘病的病因和發(fā)展過(guò)程至今還沒(méi)有完全認(rèn)識(shí)清楚，其病理機(jī)制也一直是醫(yī)學(xué)上的重要難題。
　　 氣道是氣體進(jìn)出肺的通道。有哮喘的人呼吸道發(fā)炎，這使得呼吸道變腫脹也非常敏感。他們往往對(duì)某些吸入物質(zhì)反應(yīng)強(qiáng)烈。當(dāng)氣道反應(yīng)，周?chē)募∪馐站o時(shí)，氣道縮小，造成流入肺部的氣體不足。甚至腫脹也可以惡化，使氣道更窄。
　　 氣道平滑肌的增生則

2、是哮喘的主要發(fā)病癥狀之一，有報(bào)道證明在哮喘個(gè)體的肌細(xì)胞的增生速度遠(yuǎn)高于非哮喘個(gè)體。雖然皮質(zhì)類(lèi)固醇通過(guò)減少細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)以及視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白磷酸化，能抑制正常氣道中肌細(xì)胞的增生，但是在哮喘個(gè)體中卻沒(méi)有效果。盡管做了如此多的研究，但是關(guān)于氣道平滑肌增生還有很多問(wèn)題額待解決。
　　 氣道上皮組織在呼吸道系統(tǒng)的防御中起著至關(guān)重要的作用，氣道上皮組織通過(guò)其攔截系統(tǒng)阻止組織外源有害刺激對(duì)氣道上皮的損害，從而保護(hù)呼吸道，上皮脫落，特

3、別是在痰中有成團(tuán)的上皮細(xì)胞以及支氣管中的上皮脫落是上皮受損的明顯現(xiàn)象，在接下來(lái)的上皮修復(fù)過(guò)程中，氣道上皮會(huì)分泌促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移的信號(hào)因子，這些因子中很多都能刺激起氣道平滑肌的增生。
　　 氣道中無(wú)論是氣道平滑肌還是氣道上皮在哮喘發(fā)生時(shí)都有顯著的病理特征，但是兩者之間存在怎樣的信號(hào)交流，目前還沒(méi)有完整的理論和解釋。目前研究人員做了大量關(guān)于氣道平滑肌的研究，但是關(guān)于氣道上皮組織對(duì)氣道平滑肌增生的影響尚未有報(bào)道。本課題組在體外用多聚

4、左旋精氨酸(poly-L，arginine，PLA)構(gòu)建上皮細(xì)胞(AEC)損傷模型，并與正常平滑肌細(xì)胞(ASMC)共培養(yǎng)(我們?cè)谙l(fā)病過(guò)程中，嗜酸性粒細(xì)胞是主要的效應(yīng)細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白(ECP)是其主要效應(yīng)成分。PLA作為ECP的類(lèi)似物，可以在體外模擬細(xì)胞受損傷的狀態(tài))。而為了更真實(shí)地模擬哮喘發(fā)生時(shí)氣道上皮組織的狀況，本課題還在共培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)AEC施加外部壓力。最后檢測(cè)共培養(yǎng)系統(tǒng)中ASMC增殖情況，以此對(duì)氣道上皮組織對(duì)氣道平

5、滑肌增生的影響作一個(gè)初步探索：
　　 ①為了構(gòu)建體外模型：本課題在體外收集并培養(yǎng)AEC和ASMC，并用形態(tài)學(xué)和免疫熒光學(xué)方法對(duì)收集到的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。鑒定結(jié)果表明，用組織塊貼壁法獲得了大量的原代ASMC，用胰蛋白酶冷消化法獲得了大量的AEC。
　　 ②PLA對(duì)大鼠氣道上皮細(xì)胞活性影響研究：設(shè)置不同0-50μM(每5μM濃度差為一個(gè)間隔梯度)共10個(gè)濃度梯度的PLA對(duì)AEC進(jìn)行處理，處理時(shí)間為24h。然后用臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)

6、。最后結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，即使小濃度的PLA(5μM)也對(duì)氣道上皮細(xì)胞有明顯的毒性作用(P<0.01).而在PLA濃度大于20μM時(shí)，毒性作用的變化不再明顯(PLA濃度>20μM時(shí)各組分之間的P>0.01)。
　　 ③AEC損傷模型構(gòu)建：對(duì)AEC進(jìn)行高濃度(50μM)PLA短時(shí)間處理(10分鐘)，構(gòu)建氣道上皮細(xì)胞損傷模型。
　　 ④共培養(yǎng)裝置的設(shè)計(jì)：為了在共培養(yǎng)時(shí)能對(duì)氣道上皮細(xì)胞進(jìn)行單獨(dú)施壓，我們改進(jìn)了共培養(yǎng)的壓力提

7、供裝置。最后，我們?cè)谠O(shè)計(jì)的裝置能提供我們需要的穩(wěn)定壓力(14KPa)。
　　 ⑤本實(shí)驗(yàn)設(shè)置5個(gè)實(shí)驗(yàn)組：ASMC單獨(dú)培養(yǎng)為對(duì)照組(A)、ASMC與AEC共培養(yǎng)(B)、ASMC與受損傷的AEC共培養(yǎng)(C)、ASMC與未受損傷的AEC共培養(yǎng)并施加外部壓力(D)、ASMC與受損傷的AEC共培養(yǎng)并施加外部壓力(E)
　　 ⑥共培養(yǎng)條件下ASMC增值檢測(cè)：每12h用MTT測(cè)量一次ASMC的生長(zhǎng)OD值，共取5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，既12h、24h