氣道平滑肌被動剛度和收縮力維持及相關(guān)調(diào)控機制的研究.pdf

1、哮喘?。ˋsthma）是目前世界上最常見的慢性呼吸道疾病之一，并已經(jīng)被公認為是人類公共衛(wèi)生健康的重大威脅，但令人遺憾的是，我們至今還不能很好地解釋哮喘病的發(fā)病機理和發(fā)展過程。哮喘病最主要的病理學(xué)特征是氣道受到刺激之后的過度收縮反應(yīng)，又被稱為氣道的高反應(yīng)性(Airway Hyperresponsiveness, AHR)。氣道平滑肌作為主導(dǎo)氣道收縮的因素，它的力學(xué)行為及其收縮性能，包括其剛度，收縮力，力-速率關(guān)系等力學(xué)特性，對于氣道的力學(xué)

2、反應(yīng)和哮喘病研究具有重要的生理病理學(xué)意義，然而目前我們對于平滑肌力學(xué)性質(zhì)的了解目前還存在很大的空白，近期研究結(jié)果顯示，哮喘病人的氣道平滑肌在受到拉伸之后，維持收縮力和恢復(fù)收縮力的能力顯著高于健康人；另一方面，氣道平滑肌的剛度，作為調(diào)節(jié)氣道可擴張性的重要因素，一直以來被作為哮喘研究的重要目標。因此，本研究在眾多的氣道平滑肌力學(xué)性質(zhì)之中選擇了氣道平滑肌剛度和維持收縮力的能力作為研究方向，采用了氣道平滑肌組織，探索了剛度和維持收縮力作用以及其

3、背后的信號通路和超微結(jié)構(gòu)，主要的研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　1）氣道平滑肌剛度可以獨立于主動收縮力被調(diào)控，而Rho激酶（ROCK）是調(diào)控這一機制的信號通路。為了觀察細胞骨架剛度的變化，我們建立了細胞膜透化的氣道平滑肌組織，分離了肌球蛋白磷酸化和主動收縮對剛度產(chǎn)生的影響，實驗中搭配使用鈣離子和乙酰膽堿作為調(diào)控因子，觀察記錄并分析被動剛度變化。結(jié)果表明細胞骨架剛度并非完全被動,在pCa=10-9的情況下10-4M乙酰膽堿仍然可以顯著提高

4、通透化平滑肌的剛度，更重要的是，在平滑肌剛度增加的同時，并沒有檢測到主動收縮力的產(chǎn)生，肌肉繼續(xù)維持靜息張力，與此同時未偵測到任何肌球蛋白輕鏈（MLC20）磷酸化。進一步研究顯示，ROCK抑制劑 H1152(1μM)完全沉默了這一被動剛度變化，而調(diào)控主動收縮過程的肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）抑制則對這一剛度反應(yīng)沒有影響。
　　2）氣道平滑肌維持收縮力的能力，特別是在收縮中對抗機械拉伸的機制是由ROCK通路調(diào)節(jié)的。為了研究平滑肌維持收

5、縮力的能力及其信號通路，本試驗中使用了四種不同的抑制劑，分別是：蛋白激酶C（PKC）抑制劑GF109023x(15μM),肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）抑制劑 ML-7(5μM)，Rho激酶（ROCK）抑制劑Y27632(3μM)以及H1152(3μM)，這些抑制劑分別抑制了平滑肌收縮中最重要的三個通路。為了排除不同抑制劑對主動收縮力的影響，試驗中的每一組肌肉收縮力都通過不同濃度的抑制劑（實驗組）或乙酰膽堿（對照組）匹配到50％的最大等長

6、收縮力（Fmax）。實驗記錄氣道平滑肌產(chǎn)生的等長收縮力達到峰值之后100s內(nèi)維持等長收縮力的能力，數(shù)據(jù)結(jié)果顯示GF109023x以及ML-7沒有影響平滑肌維持等長收縮力的能力，然而兩個不同的ROCK抑制劑都顯著的降低了平滑肌維持收縮力的能力。為了模擬深呼吸（DI）對氣道的舒張（Bronchodilation effect）作用，進一步試驗對正在收縮的平滑肌加入了25%Lref的機械拉伸，100s連續(xù)的周期拉伸數(shù)據(jù)顯示了和之前試驗相似的數(shù)

7、據(jù)：對照組數(shù)據(jù)顯示平滑肌在第一個次牽拉之后收縮力對抗力學(xué)拉伸的反應(yīng)停留在一個穩(wěn)定的水平，GF109023以及ML-7的反應(yīng)與對照組相同，而Y27632和H1152顯著地抑制了氣道平滑肌在收縮中對抗力學(xué)拉伸的能力。進一步研究集中于力學(xué)拉伸之后收縮力的恢復(fù)過程，數(shù)據(jù)表明只有ML-7沒有影響收縮力的恢復(fù)，而ROCK抑制劑和PKC抑制劑都顯著減緩了氣道平滑肌受到拉伸后恢復(fù)收縮力的能力。
　　3）氣道平滑肌維持收縮力的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是肌球蛋白的聚

8、合，而ROCK是調(diào)控這一過程的信號通路。為了研究氣道平滑肌維持收縮力和在收縮過程中對抗機械拉伸能力的超微結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，并研究調(diào)節(jié)該結(jié)構(gòu)變化的機制，試驗同時使用了 ROCK抑制劑Y27632和PKC抑制劑GF109023x，我們在肌肉達到收縮力峰值時固定組織并做肌肉橫截面的電鏡超薄切片，取得圖像后分析不同實驗組的肌球蛋白絲密度。結(jié)果顯示在等長收縮力峰值相同的前提下，GF109023x抑制組和對照組的肌球蛋白重鏈密度沒有顯著差異，而ROCK通路