中藥甾體皂苷引起子宮平滑肌收縮的作用機制研究.pdf

1、目的：
　　宮血寧膠囊（GXN）是利用云南省道地中藥材重樓開發(fā)的總甾體皂苷(TSSPs)制劑，目前已成為國內(nèi)婦科專家首推的治療婦科血癥的中成藥制劑。在既往的研究中我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)GXN能夠增強子宮收縮和促凝血功能是治療異常子宮出血(AUB)的兩個關鍵藥效學基礎，并通過植化研究鑒定出十余種甾體皂苷，進行構效關系分析確定了具有螺甾結構的偏諾類皂苷具有顯著的促子宮平滑肌收縮活性，并且研究證實了單體Tg引起大鼠血小板聚集、促進凝血的信號轉(zhuǎn)導通

2、路。然而，甾體皂苷引起子宮平滑肌收縮的藥理學作用，尤其是作用的信號轉(zhuǎn)導通路尚不十分清楚。本研究的目的在于探索中藥甾體皂苷誘導子宮平滑肌收縮的信號轉(zhuǎn)導通路，明確甾體皂苷縮宮作用機制，為尋找作用靶點以及藥物的二次開發(fā)提供理論依據(jù)。
　　內(nèi)容：
　　明確偏諾皂苷Tg誘導的大鼠子宮平滑肌收縮與MLC20磷酸化的關系;探討PLC-IP3、RhoA/ROK、ERK/MAPK、P38/MAPK、JNK/SAPK和PKC等可能通路的參與與否

3、以及通路間的相互作用;構畫Tg引起子宮平滑肌收縮的分子機制圖。
　　方法：
　　選用120～140g的雌性SD大鼠、采用組織塊貼壁法進行原代大鼠子宮平滑肌細胞的分離和培養(yǎng);利用離體子宮平滑肌收縮實驗研究Tg的體外效應和各種抑制劑對Tg作用的影響;采用蛋白免疫印跡(Western blotting)技術檢測可能涉及的信號通路中信號蛋白肌球蛋白輕鏈(MLC20)、ERK、p38、JNK和鈣調(diào)結合蛋白(CaD)的磷酸化改變;利用細

4、胞內(nèi)鈣離子標記、激光共聚焦檢測平滑肌細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。
　　結果：
　　1.Tg引起子宮平滑肌收縮效應的確定以及收縮與MLC20磷酸化效應的關系
　　從總甾體皂苷(TSSPs)中分離提取的單體化合物Tg具有顯著的促子宮平滑肌收縮作用，作用的起始濃度為1.25μM，隨著給藥濃度的增加，收縮效應逐漸增強。已知生理狀態(tài)下平滑肌細胞內(nèi)p-MLC20表達水平與平滑肌收縮密切相關，為了揭示Tg誘導的大鼠子宮平滑肌收縮作用是否

5、與平滑肌細胞內(nèi)MLC20磷酸化關聯(lián)，采用western blotting技術評價Tg刺激后胞內(nèi)MLC20磷酸化水平的改變，發(fā)現(xiàn)Tg能夠呈劑量和時間依賴性誘導組織細胞內(nèi)p-MLC20表達水平的升高。MLC20磷酸化反應通常由MLCK介導，應用MLCK特異性抑制劑ML-7能夠顯著抑制Tg誘導的MLC20磷酸化以及子宮平滑肌收縮。而MLCK主要通過活化的CaM來激活，應用CaM特異性抑制劑W-7也能顯著抑制Tg誘導的p-MLC20水平升高及子

6、宮平滑肌收縮效應。
　　2.平滑肌細胞[Ca2+]i對MLC20磷酸化和Tg縮宮作用的影響
　　為了驗證[Ca2+]i在Tg引起子宮平滑肌收縮以及MLC20磷酸化效應中的角色，研究首先從檢測[Ca2+]i水平的改變?nèi)胧?。?.5μM Tg刺激預先以Fluo4-AM共孵育的子宮平滑肌細胞，激光共聚焦顯微鏡下可見Tg刺激后，細胞內(nèi)熒光強度顯著性增高，作用12s出現(xiàn)熒光強度的峰值，持續(xù)1-2s后很快下降，提示Tg能夠刺激子宮平滑肌

7、細胞內(nèi)[Ca2+]i瞬時升高，形成“鈣振蕩”。去除細胞外鈣或利用L型鈣離子通道阻斷劑尼群地平以阻斷外鈣內(nèi)流，或利用thapsigargin內(nèi)鈣耗竭劑阻斷內(nèi)鈣釋放，都能顯著抑制Tg誘導的子宮平滑肌收縮以及p-MLC20水平的升高。應用PLC/IP3信號通路的特異性抑制劑幾乎完全抑制Tg的縮宮作用以及p-MLC20水平升高。另外，Rethunium Red(蘭尼堿受體(RYR)的特異性阻滯劑）能夠阻止鈣離子與受體的結合，從而抑制Ca2+引發(fā)

8、的Ca2+釋放(CICR)，應用54μ M Rethunium Red能抑制Tg縮宮作用的發(fā)揮。
　　3.RhoA/ROK信號通路在Tg縮宮機制中的調(diào)節(jié)作用
　　RhoA/ROK信號通路的激活可以通過使MLCP失活而提高p-MLC20濃度。應用ROK特異性抑制劑Y27632的既能夠抑制Tg引起的子宮平滑肌收縮，也能抑制平滑肌細胞內(nèi)p-MLC20升高。
　　4.ERK/MAPK信號通路在Tg誘導的子宮平滑肌收縮中的調(diào)節(jié)作

9、用MEK特異性抑制劑U0126能夠抑制Tg誘導的子宮平滑肌收縮，主要表現(xiàn)為收縮頻率的降低;并且，Tg呈劑量和時間依賴地引起子宮平滑肌細胞內(nèi)ERK1/2磷酸化水平的升高，這一效應能夠被U0126完全抑制;Tg還能引起CaD的磷酸化效應增強，可以被U0126部分抑制。為了驗證ERK/MAPK通路的激活是否由ras/raf途徑介導，檢測raf蛋白的表達發(fā)現(xiàn)Tg尚能夠引起平滑肌細胞內(nèi)p-c-Raf表達的升高，具有時間依賴性;而應用ras阻斷劑可

10、以抑制Tg誘導p-ERK1/2升高。
　　5.p38/MAPK和JNK/SAPK信號通路在Tg誘導的子宮平滑肌收縮中的調(diào)節(jié)作用
　　已有研究表明在其他平滑肌組織中p38/MAPK和JNK/SAPK信號通路參與收縮調(diào)節(jié)。我們的研究提示，Tg能夠誘導子宮平滑肌細胞內(nèi)p-p38和p-JNK水平的升高，效應具有時間和劑量依賴性。此外，在Tg引起子宮平滑肌收縮后給予p38通路抑制劑SB203580或JNK抑制劑SB600125均能抑制

11、Tg的促收縮效應以及CaD磷酸化效應。
　　6.參與調(diào)節(jié)Tg引起子宮平滑肌收縮的信號通路間相互交叉
　　通過各種抑制劑的應用，發(fā)現(xiàn)ras/raf/ERK/MAPK信號通路不僅能夠引起ERK1/2磷酸化，同時也能促進p-MLC20的產(chǎn)生;引起p-MLC20升高的PLC/IP3信號通路的激活也能引起p-ERK1/2表達水平的升高，而給予CaM抑制劑W-7和MLCK抑制劑ML-7對Tg的促ERK1/2磷酸化效應幾乎無影響;0.4μ

12、M的PKC抑制劑GFX能夠顯著抑制Tg引起的子宮平滑肌細胞內(nèi)p-ERK1/2水平的升高，提示Tg引起的PLC/IP3通路的激活不僅使p-MLC20表達升高，還有可能通過PKC途徑介導產(chǎn)生p-ERK1/2水平的升高。
　　結論：
　　以代表化合物Tg作為分子探針研究多個信號轉(zhuǎn)導通路在中藥甾體皂苷引起子宮平滑肌收縮中的作用機制，我們首次發(fā)現(xiàn):參與甾體皂苷縮宮作用調(diào)節(jié)涉及多個信號通路的激活、形成通路網(wǎng)絡，可能存在多個作用靶點。一方

13、面，Tg的縮宮作用與p-MLC20表達水平升高密切相關。Tg通過激活子宮平滑肌細胞膜鈣離子通道引起外鈣內(nèi)流以及PLC/IP3信號通路引起內(nèi)鈣釋放使平滑肌細胞[Ca2+]i提高而升高p-MLC20水平;RhoA/ROK信號通路的激活不依賴[Ca2+]i，通過使MLCP失活而提高p-MLC20濃度，起到鈣增敏作用，最終引起子宮平滑肌的收縮。Ca2+引發(fā)的Ca2+釋放(CICR)機制也參與[Ca2+]i的調(diào)節(jié)，增強Tg的縮宮效應。另一方面，T