改變PTEN基因的表達(dá)對(duì)人氣道平滑肌遷移的影響.pdf

1、背景：支氣管哮喘(Bronchial asthma,asthma)是由多種細(xì)胞和細(xì)胞成分參與的氣道慢性炎癥疾患.這種慢性炎癥導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性,通常出現(xiàn)廣泛多變的可逆性氣流受限。如果哮喘持續(xù)發(fā)展,氣流受限可變?yōu)椴糠挚赡?。目前認(rèn)為,這與氣道重塑的發(fā)生有關(guān)。氣道壁重塑伴有氣道上皮增生、上皮下纖維肌化、氣道平滑肌增生、微血管發(fā)生和腺體的肥大等結(jié)構(gòu)改變。各種炎癥介質(zhì)及炎癥細(xì)胞對(duì)氣管反復(fù)損傷和機(jī)體對(duì)損傷性刺激的修復(fù)性反應(yīng)引起的氣管發(fā)生改變,組織結(jié)構(gòu)

2、重構(gòu)。眾所周知,氣道平滑肌細(xì)胞(Human airway smooth muscle cell,HASMC)在哮喘氣道重塑中發(fā)揮著重要的作用,被認(rèn)為是哮喘氣道重塑的關(guān)鍵細(xì)胞。當(dāng)前的哮喘治療藥物,主要作用于慢性氣道炎癥,而氣道重塑未給予足夠重視。目前,抑制和減緩氣道重塑成為一個(gè)新的研究方向,因此越來(lái)越多學(xué)者將HASMC作為抑制和減緩氣道重塑的新靶點(diǎn)。
　　 第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物基因(phosphatase a

3、ndtension homologue deleted on chromosome ten,PTEN)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有磷酸酶活性的抑癌基因,定位于10q23.3,由9個(gè)外顯子組成,編碼由403個(gè)氨基酸組成的蛋白。研究表明,PTEN在等子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、大腸癌等多種腫瘤發(fā)生中起重要作用。近年來(lái)隨著研究深入,發(fā)現(xiàn)PTEN對(duì)非腫瘤疾病如:心肌肥大,高血壓動(dòng)脈粥樣硬化,支氣管哮喘哮等疾病中也發(fā)揮重要的作用。PTEN可以通過(guò)阻斷磷脂酞

4、肌醇-3-激酶信號(hào)傳導(dǎo)通路(PI3K/PKB/AKT信號(hào)通路)及絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信號(hào)傳導(dǎo)通路(Ras-Raf-MEKI/2-ERKI/2信號(hào)通路)等抑制腫瘤細(xì)胞、心肌和血管內(nèi)皮等細(xì)胞的增殖、遷移,促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。
　　 在致死性及非致死性哮喘中可見(jiàn)明顯平滑肌細(xì)胞增生、肥大和平滑肌向氣道上皮、內(nèi)膜的遷移發(fā)生,這在氣道重塑中起了重要的作用,使氣道壁增厚,導(dǎo)致基礎(chǔ)氣道阻力增加和不可逆性氣流阻塞的發(fā)生。這些都間接證明HA

5、SMC具有遷移的功能。雖然目前還缺乏HASMC向氣道內(nèi)膜直接遷移的證據(jù),但有研究發(fā)現(xiàn),在哮喘患者氣道活檢組織標(biāo)本中,氣道固有層內(nèi)發(fā)現(xiàn)的肌纖維母細(xì)胞在顯微結(jié)構(gòu)、形態(tài)學(xué)和位置方面都與HASMC極其相似,提示肌纖維母細(xì)胞可能是HASMC遷移并轉(zhuǎn)化而來(lái)。這種遷移與動(dòng)脈粥樣硬化時(shí)血管平滑肌細(xì)胞(Vascularsmooth muscle cell,VSMC)的遷移相類(lèi)似。而且有文獻(xiàn)表明,PTEN的過(guò)表達(dá)能抑制基礎(chǔ)和PDGF誘導(dǎo)的VSMC的增殖,遷

6、移和存活。因此我們推理:PTEN可能對(duì)HASMC的增殖、遷移等的主要信號(hào)傳導(dǎo)通路有類(lèi)似地影響。本實(shí)驗(yàn)主要側(cè)重于改變表達(dá)PTEN對(duì)HASMC遷移的影響。
　　 目的：通過(guò)攜帶綠色熒光蛋白(GFP)的腺病毒載體體外轉(zhuǎn)染人氣道平滑肌細(xì)胞(Human airway smooth muscle cell,HASMC),使腫瘤抑制基因PTEN的過(guò)表達(dá)和RNA干擾表達(dá),并以空載腺病毒(Ad-GFP)及空白組(DMEM)作為陰性對(duì)照,觀察其對(duì)H

7、ASMC遷移的影響,并探討其作用機(jī)制。
　　 材料與方法：
　　 1、取南方醫(yī)院胸外科同期做肺葉切除術(shù)患者的正常肺葉、段支氣管標(biāo)本,(經(jīng)患者及家屬同意)組織塊貼壁法培養(yǎng)人支氣管平滑肌細(xì)胞(HASMC),取第3-8代細(xì)胞,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。光鏡下觀察和細(xì)胞免疫組化(α-actin)進(jìn)行HASMC鑒定.
　　 2、實(shí)驗(yàn)分為四組:(1)利用攜帶野生型PTEN基因的重組腺病毒(Ad-GFP-PrEN)轉(zhuǎn)染HASMC,實(shí)現(xiàn)PTEN

8、的過(guò)表達(dá)；(2)針對(duì)PTEN基因的腺病毒短發(fā)夾狀RNA(shRNA)載體(Ad-GFP-shRNA-PTEN)轉(zhuǎn)染HASMC,實(shí)現(xiàn)PTEN的干擾表達(dá)；(3)以感染空載腺病毒(Ad-GFP)轉(zhuǎn)染HASMC；(4)只加入無(wú)血清培養(yǎng)基的空白組(DMEM)作為對(duì)照。重組腺病毒感染HASMC:選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HASMC,加入用無(wú)血清的DMEM稀釋的病毒液,置于37℃、飽和濕度、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育,4h后補(bǔ)加含有血清的完全培養(yǎng)基,繼續(xù)孵育2

9、4h后,更換完全培養(yǎng)基,通過(guò)在倒置熒光顯微鏡下觀察病毒轉(zhuǎn)染效果。并用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)確立最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)(MOI,multiplicity of infection)。
　　 3、通過(guò)Transwell趨化小室和細(xì)胞劃痕試驗(yàn)(Wound healing assay)檢測(cè)四組(Ad-GFP-PTEN、Ad-GFP-shRNA-PTEN、Ad-GFP、DMEM)HASMC的跨膜遷移能力和橫向遷移能力的變化。其中劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)量HASMC距離應(yīng)用

10、圖像處理軟件Image J.
　　 4、Western blot法檢測(cè)PTEN蛋白的表達(dá)和AKT、ERK1/2通路的活化情況,檢測(cè)相應(yīng)信號(hào)通路在細(xì)胞遷移中的蛋白表達(dá)的改變,并探討其作用。并加入兩通路的抑制劑(LY294002、U0126)作為陽(yáng)性對(duì)照。
　　 5、應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,用x±s對(duì)資料進(jìn)行描述,用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,組間比較采用LSD法。如果方差不齊,應(yīng)用方差近似檢驗(yàn),組件比

11、較用Dunnett's T3檢驗(yàn)。選取檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。圖片處理使用Image J軟件。
　　 結(jié)果：
　　 1、應(yīng)用倒置相差顯微鏡觀察,HASMCs未匯合之前多呈梭形或多邊形,內(nèi)有1～2個(gè)細(xì)胞核。細(xì)胞匯合后部分區(qū)域細(xì)胞束狀排列,呈典型“峰、谷”狀。細(xì)胞免疫組化法檢測(cè)平滑肌細(xì)胞表型標(biāo)志物α-actin,光鏡下可見(jiàn)α-肌動(dòng)蛋白(棕黃色顆粒)在胞質(zhì)內(nèi)均勻分布。
　　 2、用空載病毒載體Ad-GFP轉(zhuǎn)染HASMC,

12、在25、50、100、150、200不同MOI條件下,24小時(shí)流式檢測(cè)的轉(zhuǎn)染效率在70％-99％之間,當(dāng)MOI≥100時(shí)轉(zhuǎn)染效率達(dá)到95％以上,趨于穩(wěn)定。因此確定最佳感染復(fù)數(shù)為MOI=100。各組腺病毒均以MOI=100轉(zhuǎn)染HASMC,48h后倒置顯微鏡下觀察,陽(yáng)性細(xì)胞的綠色熒光蛋白GFP表達(dá)滿視野。
　　 3、Western blot免疫印跡法法檢測(cè)PTEN蛋白的表達(dá):轉(zhuǎn)染Ad-GFP-shRNA-PTEN后,干擾組PTEN基

13、因表達(dá)減弱；轉(zhuǎn)染Ad-GFP-PTEN后,過(guò)表達(dá)組PTEN基因表達(dá)明顯增強(qiáng)；而陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組,PTEN基因的表達(dá)無(wú)明顯變化。
　　 4、Western blot免疫印跡法法檢測(cè)AKT、ERK蛋白的表達(dá):與對(duì)照組相比,Ad-shPTEN組細(xì)胞p-AKT表達(dá)明顯增高,而Ad-PTEN組細(xì)胞p-AKT的表達(dá)減少,p-AKT抑制劑LY294002作為抑制p-AKT的陽(yáng)性對(duì)照,五組總AKT表達(dá)無(wú)明顯差異:與對(duì)照組相比Ad-shPT

14、EN組細(xì)胞p-ERK表達(dá)降低,但Ad-PTEN組p-ERK表達(dá)無(wú)明顯變化,p-ERK抑制劑U0126作為抑制p-ERK的陽(yáng)性對(duì)照,五組總ERK表達(dá)無(wú)明顯差異。
　　 5、Transwell趨化小室法證明與空白對(duì)照組(DMEM)(393.78±28.46)和陰性對(duì)照組(Ad-GFP)(395.78±51.50)相比過(guò)表達(dá)組(Ad-PTEN)(147.89±32.83)能顯著抑制HASMC的遷移活動(dòng)(P=0.000)；而干擾組(Ad

15、-shPTEN)(405.33±81.74)與兩對(duì)照組(Ad-GFP、DMEM)相比細(xì)胞遷移活動(dòng)沒(méi)有顯著增加,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.000)；陰性對(duì)照組(Ad-GFP)與空白對(duì)照組(DMEM)兩者相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.000)；PDK/AKT通路抑制劑組(LY294002)(70.56±12.95)作為抑制HASMC遷移的陽(yáng)性對(duì)照組與其他4組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000):劃痕修復(fù)法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與transwell法基本相同

16、,再次印證了與兩對(duì)照組相比,Ad-PTEN組(121.76±20.66)能抑制HASMC的遷移(P=0.000),而Ad-shPTEN組(236.47±55.14)細(xì)胞遷移活動(dòng)沒(méi)有顯著增加(P=0.564vsAd-GFP,P=0.229vsDMEM)而Ad-GFP組(225.79±29.52)與DMEM組(258.88±55.06)沒(méi)有顯著性差異(P=0.079),LY294002(81.17±14.40)組作為抑制HASMC遷移的陽(yáng)性

17、對(duì)照組與其他4組有顯著性差異(P=0.000vsAd-shPTEN&Ad-GFP&DMEM,P=0.033vsAd-PIEN)結(jié)論本文通過(guò)腺病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染HASMC,使抑癌基因PTEN在細(xì)胞實(shí)現(xiàn)的過(guò)表達(dá)和干擾表達(dá),探討PTEN對(duì)HASMC的遷移的影響,并討論其分子信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　 結(jié)論:
　　 1、本實(shí)驗(yàn)用transwell法和劃痕法檢測(cè)細(xì)胞的遷移結(jié)果表明,與兩對(duì)照組相比Ad-PTEN組細(xì)胞的遷移也受到了明顯的抑制,