蛋白質(zhì)糖基化抑制劑衣霉素與紫杉醇聯(lián)合用藥的抗腫瘤作用研究.pdf

1、乳腺癌是女性最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其中約有15-20％的乳腺癌患者屬于三陰性乳腺癌(Triple negative breast cancer，TNBC)。三陰性乳腺癌由于缺乏受體表達(dá)，目前尚未發(fā)現(xiàn)其特異性的治療指征，因此是惡性程度及復(fù)發(fā)率最高、轉(zhuǎn)移最快、預(yù)后最差的女性惡性腫瘤。有研究表明PI3K/AKT信號(hào)通路在調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、分化、運(yùn)動(dòng)和代謝中發(fā)揮著重要作用，而絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protei

2、n kinases，MAPKs)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與細(xì)胞增殖和凋亡有密切關(guān)系。PI3K/AKT信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路的異?；罨鹆薚NBC的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。
　　紫杉醇是一種廣泛應(yīng)用于多種腫瘤治療的細(xì)胞毒類藥物。紫杉醇可以通過(guò)抑制微管解聚將細(xì)胞周期阻礙在G2/M期，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡。然而，有文獻(xiàn)報(bào)道紫杉醇可以引起PI3K/AKT信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路的激活進(jìn)而使腫瘤細(xì)胞對(duì)紫杉醇產(chǎn)生耐藥性。
　　衣霉素作為一種蛋白質(zhì)N-糖基化

3、抑制劑不僅可以抑制腫瘤生長(zhǎng)，還具有降低藥物抗性的作用。研究發(fā)現(xiàn)，衣霉素不僅通過(guò)降低P糖蛋白(Pgp)的糖基化水平降低PgP功能，而且可以抑制PI3K/AKT和MAPK通路的激活，從而增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　本課題選用三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株，對(duì)衣霉素和紫杉醇單獨(dú)或聯(lián)合用藥的細(xì)胞增殖抑制作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，通過(guò)軟件處理計(jì)算兩種藥物的相互作用指數(shù)，確定藥物之間的作用方式。然后對(duì)衣霉素和紫杉醇聯(lián)合用藥的

4、增效作用機(jī)制進(jìn)行探討，首先在細(xì)胞水平上研究衣霉素是否會(huì)促進(jìn)紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并對(duì)于紫杉醇引起的周期阻滯及微管蛋白聚合的影響進(jìn)行研究，之后探討衣霉素對(duì)紫杉醇引起的PI3K/AKT和MAPK信號(hào)通路異常激活的影響。在體外水平上進(jìn)行初步研究后，為了證實(shí)體外實(shí)驗(yàn)結(jié)論的可靠性，我們構(gòu)建了表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的MDA-MB-231/GFP荷瘤裸鼠模型，在復(fù)雜的機(jī)體環(huán)境中研究衣霉素和紫杉醇單獨(dú)或聯(lián)合用藥對(duì)于腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用，并對(duì)聯(lián)合用藥的

5、抗腫瘤作用機(jī)制進(jìn)行研究。本論文取得的研究結(jié)果如下:
　　1.在MDA-MB-231細(xì)胞中，衣霉素與紫杉醇對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用具有協(xié)同效應(yīng)。
　　采用SRB法檢測(cè)衣霉素和紫杉醇單獨(dú)或聯(lián)合用藥后MDA-MB-231細(xì)胞的數(shù)量變化發(fā)現(xiàn)，衣霉素或紫杉醇單獨(dú)給藥，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用均存在濃度依賴性關(guān)系。其中衣霉素的IC50值是4.68±0.25μg/ml，紫杉醇的IC50值是0.28±0.10μg/ml。不同濃度紫杉醇與衣霉素聯(lián)合用藥

6、組相互作用指數(shù)均小于1，說(shuō)明兩種藥物聯(lián)合用藥對(duì)于MDA-MB-231細(xì)胞的增殖抑制存在協(xié)同作用。
　　2.衣霉素促進(jìn)了紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，衣霉素單獨(dú)給藥會(huì)造成6％的腫瘤細(xì)胞發(fā)生早期凋亡，10.7％的細(xì)胞發(fā)生晚期凋亡;紫杉醇給藥會(huì)誘發(fā)7.5％的早期凋亡和20％的晚期凋亡。與單獨(dú)用藥相比，衣霉素和紫杉醇聯(lián)合用藥可以顯著性提高凋亡細(xì)胞（包括22.8％的早期凋亡細(xì)胞和22

7、.1％的晚期凋亡細(xì)胞）所占比例。通過(guò)對(duì)MDA-MB-231進(jìn)行細(xì)胞核染色后形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，農(nóng)霉素給藥后會(huì)造成細(xì)胞核質(zhì)固縮，證實(shí)衣霉素的促凋亡活性。
　　3.在MDA-MB-231細(xì)胞中，衣霉素沒(méi)有改變紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯，但改變了微管蛋白的聚合。
　　流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果表明，衣霉素會(huì)造成腫瘤細(xì)胞G0/G1期阻滯，而紫杉醇可以將細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。與紫杉醇單獨(dú)用藥相比，1.0μg/ml衣霉素與0.1μg/ml紫杉醇聯(lián)

8、合用藥對(duì)于細(xì)胞周期分布并沒(méi)有表現(xiàn)出顯著性改變，可見(jiàn)衣霉素對(duì)于紫杉醇引起的細(xì)胞周期阻滯作用基本無(wú)影響。微管蛋白聚合免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)，衣霉素會(huì)降低紫杉醇造成的微管蛋白聚合。通過(guò)蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步表明，衣霉素引起可溶性α-tubulin單體增加，不溶性α-tubulin聚合體降低，也即聯(lián)合用藥導(dǎo)致聚合的微管蛋白數(shù)量減少。因此，衣霉素沒(méi)有改變紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯，但改變了微管蛋白的聚合。
　　4.在MDA-MB-231細(xì)胞中，衣

9、霉素降低了紫杉醇誘導(dǎo)的PI3K/AKT和MAPK信號(hào)通路的異常激活。
　　衣霉素對(duì)于腫瘤細(xì)胞中AKT、ERK、JNK和p38磷酸化的抑制作用存在劑量依賴性。紫杉醇單獨(dú)用藥可以誘導(dǎo)PI3K/AKT和MAPK信號(hào)通路的異?；罨?。與紫杉醇單獨(dú)給藥相比，衣霉素和紫杉醇聯(lián)合用藥后可以降低PI3K/AKT和MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平和磷酸化水平。
　　5.在荷瘤裸鼠試驗(yàn)中，衣霉素提高了紫杉醇對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。
　　通過(guò)

10、對(duì)于帶有GFP標(biāo)簽的MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)移瘤的觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組、衣霉素組、紫杉醇組和聯(lián)合用藥組熒光強(qiáng)度分別為1.57×1010 p/s、1.16×1010 p/s、7.24×109 p/s和3.92×109 p/s。與對(duì)照組相比較，三個(gè)給藥組的熒光總通量均顯著性降低;與紫杉醇或者衣霉素單獨(dú)給藥組相比較，聯(lián)合用藥組的熒光總通量顯著性降低。腫瘤體積變化檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，衣霉素組、紫杉醇組和聯(lián)合用藥組對(duì)于移植瘤生長(zhǎng)的抑制率分別

11、為21.1％、77.1％和92.9％。聯(lián)合用藥組與兩種藥物的單獨(dú)用藥組相比存在顯著性差異，抑制腫瘤生長(zhǎng)效果明顯好于兩者單獨(dú)用藥。Ki67組織免疫化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組、衣霉素組、紫杉醇組和聯(lián)合用藥組Ki67陽(yáng)性細(xì)胞所占比例分別為30.9％、19.9％、15.7％和8.6％。這表明對(duì)照組增殖能力強(qiáng)于其他3組藥物組，聯(lián)合用藥組對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用強(qiáng)于兩種藥物單獨(dú)用藥。采用TUNEL法檢測(cè)腫瘤組織中的細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示紫杉醇單獨(dú)用藥腫瘤組

12、織中凋亡細(xì)胞占比10.2％，而聯(lián)合給藥組中裸鼠腫瘤組織中凋亡細(xì)胞占比增加至28.9％，表明衣霉素的加入可以增強(qiáng)紫杉醇引起的細(xì)胞凋亡。
　　6.在荷瘤裸鼠的腫瘤組織中，衣霉素降低了紫杉醇誘導(dǎo)的PI3K/AKT和MAPK信號(hào)通路的異常激活，增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞促凋亡相關(guān)蛋白的活化。
　　與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，在動(dòng)物水平上檢測(cè)聯(lián)合用藥對(duì)于腫瘤細(xì)胞中AKT、ERK、JNK和p38蛋白表達(dá)和磷酸化水平的影響發(fā)現(xiàn)，衣霉素可以顯著性降低這些PI3

13、K/AKT和MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的本底表達(dá)和活化。通過(guò)對(duì)于凋亡相關(guān)蛋白caspase3和PARP的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)表明聯(lián)合用藥具有更好的促凋亡作用。
　　綜上所述，通過(guò)本課題研究，我們?cè)诩?xì)胞和動(dòng)物水平上，初步評(píng)價(jià)了衣霉素和紫杉醇聯(lián)合用藥治療三陰性乳腺癌的可行性，證明了兩種藥物之間存在協(xié)同作用。對(duì)聯(lián)合用藥增效機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，衣霉素降低了紫杉醇引起的PI3K/AKT和MAPK信號(hào)通路異?；罨鰪?qiáng)了MDA-MB-231細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏