激酶類抑制劑對紫杉醇羥化途徑的選擇性抑制以及藥物相互作用研究.pdf

1、目的：
　　紫杉醇在臨床上常與小分子激酶類抑制劑聯(lián)用以增強(qiáng)抗腫瘤效果，而大多數(shù)激酶類抑制劑對代謝酶有抑制作用，可能引起藥物之間的相互作用。本文以此為研究背景，考察12個(gè)小分子激酶類抑制劑在體外人肝微粒體中，對CYP2C8和CYP3A4介導(dǎo)的紫杉醇羥基化代謝途徑的抑制，并鑒別激酶類抑制劑對紫杉醇羥化代謝途徑的抑制選擇性。通過分子對接和光譜分析模擬激酶類抑制劑與酶蛋白的結(jié)合，應(yīng)用數(shù)學(xué)模型預(yù)測藥物相互作用的機(jī)制與程度。
　　方法：

2、
　　首先建立同時(shí)檢測紫杉醇兩個(gè)代謝物6α-羥基紫杉醇和p-3’羥基紫杉醇的LC-MS/MS定量分析方法；建立并優(yōu)化紫杉醇在體外人肝微粒體中代謝孵育體系，并同時(shí)監(jiān)測激酶類抑制劑對紫杉醇兩條代謝途徑的抑制作用，獲得12個(gè)激酶類抑制劑對CYP2C8和CYP3A4代謝途徑的可逆性抑制參數(shù)Ki，以及阿西替尼時(shí)間依賴性抑制常數(shù)KI和 kinact。通過使用谷胱甘肽捕獲阿西替尼氧化反應(yīng)的中間體，以超高效液相色譜–紫外–四級桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法（U

3、PLC-UV/Q-TOF MS）檢測反應(yīng)體系中谷胱甘肽加合物。使用分子對接模型模擬抑制劑與酶蛋白的結(jié)合，獲得對接Glide分值，考察該分值與抑制實(shí)驗(yàn)中獲得的抑制常數(shù)Ki的相關(guān)性。通過P450吸收光譜分析，考察抑制劑與酶蛋白結(jié)合類型，分析抑制劑與酶蛋白結(jié)合緊密程度與其抑制常數(shù)之間的相關(guān)性。以抑制常數(shù)和紫杉醇體內(nèi)外代謝份數(shù)為主要參數(shù)，運(yùn)用數(shù)學(xué)模型預(yù)測紫杉醇與激酶類抑制劑聯(lián)用時(shí)的藥物相互作用程度。
　　結(jié)果：
　　12個(gè)小分子激酶

4、類抑制劑對紫杉醇羥基化代謝有不同程度的抑制作用，其中尼洛替尼對CYP2C8和CYP3A4代謝途徑均有較強(qiáng)的可逆性抑制作用，Ki值分別為0.1和0.28μM。阿西替尼，拉帕替尼，尼洛替尼和索拉非尼選擇性地抑制CYP2C8介導(dǎo)的紫杉醇的羥基化代謝；而博舒替尼，達(dá)沙替尼，厄洛替尼，帕唑帕尼和舒尼替尼選擇性地抑制CYP3A4介導(dǎo)的紫杉醇的羥基化代謝。阿法替尼，吉非替尼和伊馬替尼對紫杉醇兩條羥基化代謝抑制強(qiáng)度相當(dāng)。此外，阿法替尼，厄洛替尼，吉非替

5、尼，拉帕替尼和索拉非尼對CYP2C8代謝途徑有中等程度的時(shí)間依賴性抑制作用，而除索拉非尼以外的其他激酶類抑制劑對CYP3A4代謝途徑有較強(qiáng)的時(shí)間依賴性抑制作用。阿西替尼對CYP3A4酶介導(dǎo)的紫杉醇羥基化代謝途徑有較強(qiáng)的時(shí)間依賴性抑制作用，動(dòng)力學(xué)參數(shù)KI和kinact分別為0.93μM和0.0137 min-1。用捕獲劑GSH捕獲到阿西替尼氧化中間體，說明氧化活化是產(chǎn)生時(shí)間依賴性抑制的原因。分子對接模擬分析發(fā)現(xiàn)，尼洛替尼可通過多個(gè)氫鍵和范

6、德華作用力與酶蛋白氨基酸殘基緊密結(jié)合，而舒尼替尼與酶蛋白氨基酸殘基的作用力相對較弱。實(shí)驗(yàn)獲得的CYP3A4 Glide對接分值與抑制實(shí)驗(yàn)獲得的Ki值有較好的線性相關(guān)性（r2=0.64），而CYP2C8 Glide對接分值與抑制實(shí)驗(yàn)獲得的Ki值線性相關(guān)性較弱（r2=0.51）。光譜分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大多數(shù)具有較強(qiáng)酶抑制作用的激酶類抑制劑與CYP2C8和CYP3A4的結(jié)合表現(xiàn)為II型光譜。與此結(jié)果相比較，盡管博舒替尼作為CYP2C8的強(qiáng)抑制

7、劑，但其與CYP2C8的結(jié)合并未表現(xiàn)為II型光譜。光譜實(shí)驗(yàn)獲得的抑制劑與CYP2C8（r2=0.950）和CYP3A4（r2=0.807）酶光譜解離常數(shù)Ks和可逆性抑制參數(shù)Ki有較好的線性相關(guān)性。數(shù)學(xué)模型模擬預(yù)測藥物相互作用結(jié)果顯示，紫杉醇肝攝取率的引入大大提高了預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確性。相反，時(shí)間依賴性抑制參數(shù)的引入會高估紫杉醇與激酶類抑制劑的藥物相互作用，該高估現(xiàn)象與紫杉醇CYP3A4代謝途徑的代謝份數(shù)相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　本

8、課題研究發(fā)現(xiàn)激酶類抑制劑對紫杉醇羥化代謝途徑的抑制有選擇性，并且大部分激酶類抑制劑對CYP3A4介導(dǎo)的代謝有時(shí)間依賴性抑制作用。分子對接模型模擬顯示尼洛替尼分子與CYP2C8和CYP3A4酶蛋白氨基酸殘基有較強(qiáng)的結(jié)合作用，該結(jié)果與體外抑制實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)一致。光譜分析顯示大部分激酶類抑制劑與酶蛋白結(jié)合表現(xiàn)為II型光譜。數(shù)學(xué)模型模擬預(yù)測顯示紫杉醇肝攝取率的引入大大提高了預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
　　本研究系統(tǒng)地考察了12種激酶類抑制劑對紫杉醇代謝