CDK4選擇性抑制劑的結(jié)合模式研究.pdf

1、激酶家族蛋白的一級(jí)序列有較高的同源性和ATP結(jié)合口袋殘基的高度保守性導(dǎo)致了提高激酶類抑制劑的選擇性一直成為藥物設(shè)計(jì)的難點(diǎn)。Fascaplysin是一種來(lái)自海綿的抗癌海洋生物堿，對(duì)調(diào)控細(xì)胞周期的細(xì)胞周期蛋白依賴激酶CDK4和CDK2表現(xiàn)出明顯的抑制選擇性。CDK4和CDK2的ATP結(jié)合口袋中共存在5個(gè)差異殘基，其中兩個(gè)氨基酸殘基很可能是導(dǎo)致 Fascaplysin對(duì) CDK4抑制選擇性高于 CDK2的主要原因，即 CDK4Thr102與C

2、DK2Lys89，CDK4Glu144與CDK2Gln131。研究激酶抑制劑Fascaplysin對(duì)CDK4的抑制選擇性的機(jī)理可以為基于結(jié)構(gòu)的藥物改造提供有效的指導(dǎo)信息，這有利于設(shè)計(jì)出具有更高選擇性的激酶抑制劑和減弱不必要的毒副作用。本論文利用分子生物學(xué)的基因克隆、原核表達(dá)和純化以及定點(diǎn)突變的技術(shù)在體外制備人的野生型的CDK4-cyclin D1活性激酶復(fù)合物和單點(diǎn)突變的CDK4T102K-cyclin D1、CDKE144Q-cycl

3、in D1激酶復(fù)合物以及兩點(diǎn)共突變的活性激酶復(fù)合物，并利用酶活測(cè)定的方法比較抑制劑對(duì)天然和定點(diǎn)突變后激酶的抑制能力的變化情況。采用分子對(duì)接技術(shù)直觀地從圖像上觀察抑制劑與天然和突變激酶的結(jié)合模式，共同闡釋 Fascaplysin與CDK4的選擇性抑制的機(jī)理。定點(diǎn)突變和酶活測(cè)定結(jié)果表明抑制劑Fascaplysin對(duì)突變型CDK4-cyclin復(fù)合物的抑制能力比對(duì)野生型的CDK4-cyclin D1復(fù)合物的弱，F(xiàn)ascaplysin對(duì)野生型C

4、DK4-cyclin D1的IC50為0.31μM，對(duì)CDK4T102K-cyclin D1、CDKE144Q-cyclin D1和兩點(diǎn)共突變的復(fù)合物的IC50值分別為16.36μM，3.365μM和47.56μM。分子對(duì)接的結(jié)果和 Fascaplysin對(duì)突變后激酶的抑制活性下降的結(jié)果與一致，揭示了CDK4的Thr102和Glu144這兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)確實(shí)是決定選擇性的主要原因。本論文建立的研究抑制劑與激酶結(jié)合模式的研究方法，還可以為以