HDAC抑制劑抗腫瘤效應(yīng)的機制研究.pdf

1、第一部分：研究背景：
　　 端粒酶是一種專一依賴RNA的逆轉(zhuǎn)錄酶，與細(xì)胞調(diào)控及惡性腫瘤形成密切相關(guān)，其活性升高是細(xì)胞永生化和惡性轉(zhuǎn)化過程中最重要的特征之一。人端粒酶包括3種組分：端粒酶RNA(human telomersase RNA,hTR)、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)及連結(jié)二者的端粒酶連結(jié)蛋白(Telomerase associated prot

2、ein1，TP1)。其中hTERT與端粒酶活性密切相關(guān)，被認(rèn)為是大多數(shù)細(xì)胞端粒酶激活的限速酶[1]。組蛋白去乙?；敢种苿?histone deacetylases inhibitors，HDACi)曲古抑菌素A(Trichostatin A，TSA)通過抑制組蛋白去乙酰化酶使細(xì)胞乙?；鞍自黾?，選擇性抑制和激活細(xì)胞大量基因轉(zhuǎn)錄，具有特異的腫瘤殺傷效應(yīng)[2，3]。因此，本項目從建立Trichostatin A選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡模型入

3、手，觀察Trichostatin A誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡的時間和量效關(guān)系。同時檢測端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶在Trichostatin A誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡過程中的表達變化，以此為基礎(chǔ)，探討Trichostatin A選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用機制。
　　 實驗方法：
　　 Trichostatin A選擇性誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡模型的建立：(1)倒置相差顯微鏡下觀察Trichostatin A作用宮頸癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。(2)磺酰羅丹明

4、B(RSB)法檢測Trichostatin A作用宮頸癌細(xì)胞凋亡的時間和量效關(guān)系；(3)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期改變和凋亡情況。
　　 Trichostatin A誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞凋亡過程中hTERT表達的變化：(1)RT-PCR檢測hTERT和p21Waf1基因在Trichostatin A誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡過程中的變化；(2)激光共聚焦顯微鏡檢測hTERT的細(xì)胞定位和表達變化；(3)免疫熒光結(jié)合流式檢測Trichostatin

5、 A作用前后hTERT蛋白表達變化。(4)PCR-TRAP-ELISA法檢測hTERT表達變化后端粒酶活性的改變。(5)熒光原位雜交法檢測hTERT表達變化后端粒長度的改變。
　　 hTERT顯性負(fù)突變體在Trichostatin A選擇性誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡過程中的作用：
　　 (1)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染顯性負(fù)突變(dominant negative，DN)hTERT、野生型(wild type，WT)hTERT，觀察hTERT在T

6、richostatin A誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡中的作用。(2)PCR-TRAP-ELISA法檢測轉(zhuǎn)染不同hTERT質(zhì)粒后端粒酶活性的變化(3)磺酰羅丹明B(RSB)法檢測轉(zhuǎn)染不同hTERT質(zhì)粒的穩(wěn)定細(xì)胞系在Trichostatin A作用下增殖差異；(4)Annexin V/ PI流式檢測不同轉(zhuǎn)染細(xì)胞系在Trichostatin A作用下的早期凋亡情況。(5)western blot檢測不同轉(zhuǎn)染細(xì)胞系在Trichostatin A作用下

7、p21waf1和p53的表達變化。
　　 結(jié)果：
　　 通過Trichostatin A選擇性誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡模型的建立，觀察到宮頸癌細(xì)胞在Trichostatin A作用下細(xì)胞發(fā)生明顯變化，細(xì)胞折光性降低；48h后細(xì)胞變圓飄浮，胞膜皺縮，可見凋亡小體和核碎裂；RSB法證實Trichostatin A對宮頸癌細(xì)胞的增殖抑制隨藥物濃度的增加和作用時間的延長而明顯，具有顯著的時效和量效相關(guān)性。流式細(xì)胞檢測證明Trichos

8、tatin A作用宮頸癌細(xì)胞后細(xì)胞周期阻滯，隨后細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　 Trichostatin A作用細(xì)胞后，hTERT mRNA隨誘導(dǎo)時間的變化具有一定的動態(tài)規(guī)律，而p21waf1的表達則升高。激光共聚焦顯微鏡和免疫熒光結(jié)合流式細(xì)胞儀分析從蛋白水平驗證了mRNA水平的動態(tài)變化。而進一步的端粒酶活性檢測和端粒長度的測定也證實了端粒酶活性和端粒長度隨hTERT的表達變化發(fā)生相應(yīng)的改變。以上結(jié)果提示hTERT有可能成為Trichos

9、tatin A的作用靶點。
　　 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染顯性負(fù)突變(dominant negative，DN)hTERT、野生型(wild type，WT)hTERT后，轉(zhuǎn)染DN-hTERT的細(xì)胞端粒酶的活性明顯下降，而轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-hTERT的細(xì)胞端粒酶活性則升高。端粒酶活性在不同的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的差異進一步表現(xiàn)在細(xì)胞增殖和對Trichostatin A誘導(dǎo)凋亡的耐受方面：轉(zhuǎn)染DN-hTERT的細(xì)胞增殖速度減慢，對Trichostatin A誘

10、導(dǎo)的凋亡敏感，而轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-hTERT的細(xì)胞則相反。Western blot檢測這種凋亡上的差異有可能是由于不同轉(zhuǎn)染細(xì)胞系p21waf1表達的差異引起，這種差異不依賴于p53的表達變化。
　　 結(jié)論：
　　 1 Trichostatin A可以選擇性誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡。
　　 2 hTERT在Trichostatin A誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡過程中表達發(fā)生一定的變化。
　　 3 hTERT作為Trichosta

11、tin A的作用靶點，外源性干預(yù)其表達可以改變腫瘤細(xì)胞對Trichostatin A的敏感性，這種敏感性的改變通過細(xì)胞周期調(diào)控蛋白p21waf1實現(xiàn)。
　　 第二部分：研究背景：
　　 組蛋白去乙?；敢种苿┦且活愋滦偷姆羌?xì)胞毒類抗癌化療藥物，在I、II期臨床試驗中取得了令人振奮的結(jié)果，顯示出良好的臨床應(yīng)用前景。作為一種新的腫瘤治療概念，HDAC抑制劑與傳統(tǒng)的細(xì)胞毒類化療藥物不同，其具有在腫瘤與宿主正常細(xì)胞間選擇性殺滅腫

12、瘤細(xì)胞的特性，說明其核心作用靶點具有明顯的腫瘤特異性。然而，國內(nèi)外對HDAC抑制劑的廣譜抗腫瘤的作用靶點的認(rèn)識仍然不夠明確。雖然有報道顯示一些細(xì)胞周期調(diào)控蛋白可能作為其靶點，但類似的研究仍然是零散、相對不完善的，因此，我們在第一部分研究的基礎(chǔ)上，采用一種全新的，基于功能效應(yīng)為基礎(chǔ)的篩選手段：SMART(Suppression of Mortality by Antisense Rescue Techique)技術(shù)克隆HDAC抑制劑的作用

13、靶點，試圖以一種新的角度來闡明HDAC抑制劑特異性抗腫瘤的作用機理，發(fā)現(xiàn)其新的作用靶點，發(fā)展腫瘤細(xì)胞凋亡的新的調(diào)控機制。
　　 實驗方法：
　　 Trichostatin A誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡反義cDNA文庫的構(gòu)建和凋亡效應(yīng)基因的篩選及鑒定：實驗路線及流程見下表：
　　 結(jié)果：
　　 經(jīng)MTT，流式細(xì)胞儀證實250nmol/L Trichostatin A能誘導(dǎo)MCF-7和HeLa細(xì)胞凋亡，提

14、取處于凋亡不同時期的MCF-7細(xì)胞mRNA，提取mRNA后建立的反義cDNA文庫片段插入率大于90[％]，平均長度約為1.5kb，庫容約為2×105；將此文庫質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，經(jīng)過篩選得到陽性克隆后，Hirt DNA提取轉(zhuǎn)化，經(jīng)酶切測序獲得76個EST片度。經(jīng)過生物信息學(xué)分析，選定Liv-1、Smad4和Ubiquitin B進行了詳細(xì)的機制研究。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功建立了HDAC 抑制劑Tricho