蛋白質(zhì)糖基化抑制劑衣霉素及其與HER2分子靶向性抗體藥物赫賽汀聯(lián)合用藥的抗腫瘤作用研究.pdf

1、乳腺癌是女性最常見的腫瘤之一，在乳腺癌病人中普遍存在HER2過度表達(dá)的現(xiàn)象。HER2分子是一185kDa的跨膜糖蛋白，針對HER2分子的靶向治療是近年來出現(xiàn)的一種有效的生物治療手段。靶點(diǎn)藥物如赫賽汀由于靶點(diǎn)專一，使藥物對細(xì)胞的其它代償作用及信號旁路沒有抑制作用導(dǎo)致耐藥性，大大限制了其應(yīng)用。因此，靶向藥物與其他藥物的聯(lián)合應(yīng)用是目前研究的熱點(diǎn)。
　　 衣霉素是一種能夠抑制糖蛋白N-糖鏈合成的抗生素，作為糖蛋白N-糖鏈合成抑制劑，可以

2、抑制大多數(shù)是糖蛋白的受體進(jìn)行糖基化，進(jìn)而使受體數(shù)量減少和活性降低，HER2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及其它代償途徑隨之降低。因此，衣霉素與赫賽汀的聯(lián)用既可增強(qiáng)赫賽汀的抗腫瘤效果，又能避免細(xì)胞毒藥物聯(lián)用時(shí)導(dǎo)致的毒副作用。
　　 本課題主要選用5種人乳腺細(xì)胞株:MCF-7、MCF-7/HER2、SKBR3、BT474以及MCF-10A，通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，在動物、細(xì)胞及分子各個(gè)方面深入研究了衣霉素對乳腺癌細(xì)胞的抗腫瘤作用，并從衣霉素對HER2分子及

3、其相關(guān)信號傳導(dǎo)通路分子表達(dá)及活化的影響來探討了其分子作用的機(jī)制。在此基礎(chǔ)上，本課題還對衣霉素聯(lián)合HER2分子靶向藥物赫賽汀對乳腺癌的作用進(jìn)行了初步的探索，為衣霉素與赫賽汀聯(lián)合用藥進(jìn)入臨床試驗(yàn)奠定理論基礎(chǔ)。1HER2真核表達(dá)載體pcDNA3.1/HER2以及HER2高表達(dá)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞株MCF-7/HER2構(gòu)建與鑒定
　　 采用RT-PCR的方法從人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-453中獲得HER2的cDNA序列，并將其克隆至載體p

4、GEM(R)-TEasy上，然后測序驗(yàn)證序列的正確性。將質(zhì)粒pGEM(R)-TEasy/HER2和載體pcDNA3.1分別用限制性內(nèi)切酶NheⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，然后用T4DNA連接酶連接，成功構(gòu)建出重組質(zhì)粒pcDNA3.1/HER2。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至乳腺癌細(xì)胞MCF-7中，通過G418篩選和Westernblot鑒定，獲得穩(wěn)定高表達(dá)HER2的MCF-7/HER2細(xì)胞。該細(xì)胞可以作為分子靶點(diǎn)HER2的細(xì)胞模型進(jìn)行下一步的研究。

5、>　　 2衣霉素與赫賽汀單獨(dú)或者聯(lián)合用藥的體外實(shí)驗(yàn)
　　 2.1通過CCK8檢測在衣霉素或赫賽汀單獨(dú)用藥或聯(lián)合用藥對細(xì)胞增殖的影響
　　 結(jié)果顯示，衣霉素在各種乳腺癌細(xì)胞中，均存在劑量依賴性的細(xì)胞增殖抑制作用。通過各細(xì)胞IC50的比較，我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對于衣霉素的敏感性與其HER2表達(dá)水平并不相關(guān)。赫賽汀單獨(dú)給藥時(shí)，除HER2高表達(dá)的BT474細(xì)胞對其較為敏感，其他細(xì)胞如正常無限增殖乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A，HER2低表

6、達(dá)細(xì)胞MCF-7對其均不敏感。當(dāng)固定衣霉素濃度為0.5μg/ml與赫賽汀聯(lián)用時(shí)，聯(lián)合用藥組與空白對照相比，具有明顯的抑制細(xì)胞增殖的作用，其抑制率高于衣霉素和赫賽汀單獨(dú)用藥組。另外，利用上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果和兩藥相互作用指數(shù)計(jì)算公式得知，衣霉素與赫賽汀聯(lián)合給藥處理MCF-/HER2細(xì)胞，CDI＜1，證明兩種藥物聯(lián)用具有協(xié)同抗腫瘤作用。
　　 2.2衣霉素與赫賽汀單獨(dú)或者聯(lián)合用藥對細(xì)胞凋亡的影響
　　 通過AnnexinV-FITC

7、/PI結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測衣霉素與赫賽汀單獨(dú)或者聯(lián)合用藥對細(xì)胞凋亡的影響。對兩株HER2高表達(dá)細(xì)胞株，細(xì)胞凋亡率隨著衣霉素濃度增加而升高，具有一定的劑量依賴性。同時(shí)實(shí)驗(yàn)證明，隨著給藥時(shí)間的延長，細(xì)胞的晚期凋亡率有明顯的升高。當(dāng)衣霉素濃度為0.5μg/ml時(shí)，SKBR3細(xì)胞的凋亡率由24h時(shí)的8.69％升高到48h時(shí)的15.57％，MCF-7/HER2細(xì)胞的凋亡率由24h時(shí)的7.01％升高到48h時(shí)的13.62％。赫賽汀單獨(dú)給藥時(shí)，隨赫賽汀

8、濃度遞增，MCF-7/HER2和SKBR3細(xì)胞凋亡比率增加。當(dāng)10μg/ml赫賽汀和100μg/ml赫賽汀單獨(dú)給藥處理24h時(shí)，SKBR3細(xì)胞的凋亡率分別為7.14％和12.50％，MCF-7/HER2細(xì)胞的凋亡率分別為8.74％和9.49％;當(dāng)100μg/ml赫賽汀和0.5μg/ml衣霉素聯(lián)用時(shí)，SKBR3和MCF-7/HER2細(xì)胞的凋亡率分別為14.57％和13.20％。聯(lián)合給藥組的凋亡率要高于單獨(dú)給藥組的凋亡率。因此，衣霉素單獨(dú)對

9、于該兩株細(xì)胞有良好的促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，并且能加強(qiáng)赫賽汀誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用。
　　 對于乳腺癌細(xì)胞MCF-7，細(xì)胞凋亡率隨衣霉素濃度增加而升高，而赫賽汀單獨(dú)用藥對于細(xì)胞的凋亡無明顯的作用效果。當(dāng)衣霉素與赫賽汀聯(lián)合用藥時(shí)，凋亡率較衣霉素與赫賽汀單獨(dú)給藥組稍有提高，但是并不顯著。例如，當(dāng)濃度為0.5μg/ml的衣霉素和10μg/ml的赫賽汀單藥處理細(xì)胞24h時(shí)，MCF-7細(xì)胞凋亡率是4.42％和3.01％;而二者聯(lián)用時(shí)凋亡率是5.1

10、0％;當(dāng)赫賽汀濃度為100μg/ml時(shí)，細(xì)胞凋亡率是3.40％，與0.5μg/ml衣霉素聯(lián)用時(shí)凋亡率是5.13％。
　　 通過Westernblot檢測了衣霉素與赫賽汀單獨(dú)或聯(lián)合用藥對細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響。結(jié)果顯示，對于MCF-7細(xì)胞和MCF-7/HER2細(xì)胞，衣霉素單獨(dú)和聯(lián)合用藥，促凋亡蛋白Caspase-3、Bax表達(dá)增強(qiáng)，凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)降低，且均具有劑量依賴性。赫賽汀單獨(dú)給藥時(shí)，MCF-7/HER2細(xì)胞也存在

11、Caspase-3的活化，凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)降低以及PARP的切割現(xiàn)象，但組內(nèi)三個(gè)劑量組對凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平并無明顯的差異。
　　 2.3衣霉素與赫賽汀單獨(dú)或聯(lián)合用藥對細(xì)胞周期分布的影響
　　 通過PI單染結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測衣霉素與赫賽汀單獨(dú)或聯(lián)合用藥對細(xì)胞周期分布的影響。結(jié)果顯示，對于MCF-2/HER2細(xì)胞來說，衣霉素單獨(dú)和赫賽汀單獨(dú)用藥均誘導(dǎo)細(xì)胞G1期阻滯，隨給藥時(shí)間的延長和劑量的增加G1期阻滯更為明顯

12、。將衣霉素（0.5μg/ml）和赫賽汀(10μg/ml)聯(lián)用處理MCF-7/HER2細(xì)胞，細(xì)胞亦存在G1期阻滯的現(xiàn)象，加藥處理24h，約有72.51％的細(xì)胞處于G1期，分別高于衣霉素(0.5μg/ml)單獨(dú)給藥時(shí)的65.08％和赫賽汀(10μg/ml)單獨(dú)給藥時(shí)的68.52％，但無顯著性差異。給藥48h時(shí)，細(xì)胞仍處于G1期阻滯狀態(tài)，S期細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步減少。
　　 對于MCF-7細(xì)胞，衣霉素同樣可以引起該細(xì)胞的G1期阻滯，S期細(xì)胞

13、數(shù)減少，且具有時(shí)間與劑量依賴性。但是用不同濃度的赫賽汀單獨(dú)處理細(xì)胞，細(xì)胞與對照組相比并無明顯的周期變化，該結(jié)果與增殖抑制實(shí)驗(yàn)以及凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，表明MCF-7細(xì)胞對赫賽汀不敏感。將衣霉素(0.5μg/ml)和赫賽汀(10μg/ml)聯(lián)用處理MCF-7細(xì)胞，細(xì)胞仍處于G1期阻滯。上述結(jié)果表明，衣霉素單獨(dú)或與赫賽汀聯(lián)用時(shí)，均可顯著地導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞G1期阻滯，并且S期細(xì)胞數(shù)量減少。
　　 通過Westernblot檢測了衣霉素與赫賽

14、汀單獨(dú)或聯(lián)合用藥對細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的影響。結(jié)果顯示，對于MCF-7細(xì)胞和MCF-7/HER2細(xì)胞均存在衣霉素劑量依賴性誘導(dǎo)p21和p27的表達(dá)，并顯著性下調(diào)細(xì)胞周期蛋白CyclinD1的表達(dá)水平。上述蛋白表達(dá)量的變化均可阻滯細(xì)胞由細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期。赫賽汀單獨(dú)用藥時(shí)，對于MCF-7/HER2細(xì)胞，當(dāng)赫賽汀濃度為100μg/ml時(shí)，p21和p27的表達(dá)有所升高，其他兩個(gè)濃度時(shí)，p21和p27的表達(dá)與空白相比，并無明顯變化。對于MCF-7

15、細(xì)胞，赫賽汀單藥處理抑制了p21和p27蛋白的表達(dá)。另外，對于赫賽汀單藥處理MCF-7組和MCF-7/HER2組，CyclinD1表達(dá)量與對照相比均無明顯的變化趨勢。當(dāng)固定衣霉素濃度為0.5μg/ml與不同濃度的赫賽汀聯(lián)合用藥時(shí)，對于MCF-7和MCF-7/HER2細(xì)胞，p21和p27的表達(dá)均比衣霉素單藥組和赫賽汀單藥組要高，CyclinD1的表達(dá)水平比單獨(dú)處理組低。上述結(jié)果證明，聯(lián)合給藥組比單獨(dú)給藥更好的誘導(dǎo)細(xì)胞處于G1期阻滯，與流式

16、細(xì)胞儀測定結(jié)果一致。
　　 2.4Westernblot檢測衣霉素與赫賽汀單獨(dú)或聯(lián)合用藥對細(xì)胞EGFR家族的影響
　　 結(jié)果顯示，對于MCF-7細(xì)胞和MCF-7/HER2細(xì)胞，當(dāng)衣霉素單獨(dú)用藥時(shí)，EGFR、HER2和HER3受體水平下降，EGFR和HER2的磷酸化水平也降低，且具有劑量依賴性。赫賽汀單獨(dú)用藥時(shí)，對于MCF-7/HER2，只能劑量依賴性下調(diào)HER2和EGFR受體水平及HER2磷酸化水平，EGFR的磷酸化水平

17、和HER3受體的表達(dá)量無明顯變化;然而赫賽汀單獨(dú)給藥MCF-7細(xì)胞，上述受體蛋白和磷酸化均沒有變化。當(dāng)固定衣霉素濃度為0.5μg/ml與不同濃度的赫賽汀聯(lián)合給藥時(shí)，與單獨(dú)用藥組和空白對照組相比，聯(lián)合用藥組降低HER2、EGFR和HER3受體表達(dá)水平及EGFR和HER2的磷酸化水平。
　　 2.5Westernblot檢測衣霉素與赫賽汀單獨(dú)或聯(lián)合用藥對HER2下游的兩條重要信號通路MAPK和PI3K/Akt的影響
　　 我

18、們主要對其主要的分子ERK1/2、p-ERK1/2、Akt以及p-Akt的表達(dá)進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，對于MCF-7細(xì)胞和MCF-7/HER2細(xì)胞，衣霉素單獨(dú)給藥以及聯(lián)合給藥均能抑制ERK1/2和Akt的活化，從而干擾下游信號通道的激活。同時(shí)ERK1/2和Akt本身的表達(dá)量也明顯下降。通過該實(shí)驗(yàn)我們可以推測，衣霉素及聯(lián)合用藥對細(xì)胞增殖、周期抑制以及凋亡的有效性，應(yīng)該與其抑制了MAPK信號通道和PI3K/Akt信號通道相關(guān)。
　　

19、3衣霉素單獨(dú)或與赫賽汀聯(lián)合用藥的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　 3.1采用SKBR3乳腺癌裸鼠體內(nèi)移植模型檢測衣霉素單獨(dú)用藥的抗腫瘤作用
　　 通過腫瘤體積抑制曲線和體重變化曲線顯示，衣霉素對SKBR3移植瘤的生長具有抑制作用。當(dāng)衣霉素劑量為0.005mg/kg、0.02mg/kg、0.075mg/kg時(shí)，其抑瘤率為12.9％、16％和33.5％。
　　 采用WesternBlot方法檢測衣霉素對SKBR3乳腺癌裸鼠體內(nèi)移植模型

20、瘤組織HER2蛋白的影響。研究發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，衣霉素給藥組HER2蛋白在腫瘤組織的表達(dá)量降低。而三個(gè)給藥劑量組之間，HER2蛋白的表達(dá)無明顯的差異。
　　 3.2采用MCF-7/HER2乳腺癌裸鼠體內(nèi)移植模型檢測衣霉素單獨(dú)用藥的抗腫瘤作用
　　 通過腫瘤體積抑制曲線和體重變化曲線顯示，衣霉素對MCF-7/HER2移植瘤的生長具有抑制作用。治療后，衣霉素各單獨(dú)給藥組及赫賽汀給藥組的腫瘤生長均受到抑制。治療21天后，

21、各組抑制效果為0.075mg/kg組＞0.02mg/kg組＞0.005mg/kg組，同時(shí)0.005mg/kg組與赫賽汀10mg/kg劑量組的抑制效率相當(dāng)。當(dāng)衣霉素給藥劑量為為0.02mg/kg時(shí)，其體重與赫賽汀組以及空白對照相比無明顯差異，但抑瘤率達(dá)27％;當(dāng)衣霉素劑量為0.075mg/kg時(shí)，抑瘤率高達(dá)50％，但也造成體重下降23％，具有一定的毒性。
　　 Westernblot結(jié)果顯示，衣霉素給藥處理24h，其HER2蛋白在

22、腫瘤組織的表達(dá)量與空白對照組相比無明顯的差異，而衣霉素單藥處理48h和72h，HER2表達(dá)水平較空白對照組有明顯的降低，同時(shí)48h組低于72h組。該結(jié)果說明衣霉素在體內(nèi)在48h時(shí)發(fā)揮最好的效果，72h時(shí)，療效有所下降，需要再次給藥以維持其療效。
　　 3.3采用MCF-7/HER2乳腺癌裸鼠體內(nèi)移植模型檢測衣霉素和赫賽汀聯(lián)合用藥的抗腫瘤作用
　　 聯(lián)合給藥組裸鼠瘤塊的體積低于衣霉素或赫賽汀單獨(dú)給藥組，且具有顯著性意義。與