ME2小分子抑制劑的發(fā)現(xiàn)和作用機(jī)理研究.pdf

1、目的:丙酮酸是三大營養(yǎng)物質(zhì)相互轉(zhuǎn)換的樞紐，NADPH是維持細(xì)胞內(nèi)還原性谷胱甘肽和體內(nèi)許多生化反應(yīng)的輔酶。腫瘤細(xì)胞通過提高谷氨酰胺的代謝來滿足快速增殖和生存對NADPH和丙酮酸的需求。在此過程中，NAD(P)+-依賴的蘋果酸酶2(ME2)將蘋果酸轉(zhuǎn)化成NAD(P)H和丙酮酸，是谷氨酰胺的代謝中關(guān)鍵酶，被認(rèn)為是一個潛在的抗腫瘤新靶點(diǎn)。目前人源的ME2小分子抑制劑未見報道，因此，建立ME2小分子抑制劑的高通量篩選平臺，尋找ME2的小分子抑制劑

2、為研發(fā)新型抗腫瘤的藥物奠定基礎(chǔ)。
　　方法:我們利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)純化重組的人源ME2-His融合蛋白。酶標(biāo)儀監(jiān)測ME2產(chǎn)物NADH在340nm處的特征光吸收強(qiáng)度的變化，計算反應(yīng)初速度，測定ME2的活性。通過優(yōu)化ME2測活體系中的pH值、緩沖溶液、底物濃度、ME2濃度、DMSO濃度建立ME2小分子抑制劑的高通量篩選體系。用Z'因子、性噪比評價高通量篩選體系。對國家新藥篩選中心化合物庫中化學(xué)合成的小分子化合物、網(wǎng)絡(luò)藥物發(fā)現(xiàn)平

3、臺天然產(chǎn)物（含中藥有效成分）和天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類似物進(jìn)行篩選，尋找對ME2有抑制作用的化合物。通過優(yōu)化ME2的濃度和染料濃度，建立驗(yàn)證化合物與ME2特異性結(jié)合的熱位移分析體系。通過熱位移分析方法和向篩選體系中加入表面活性劑（如Brij-35）驗(yàn)證對ME2有抑制作用化合物的特異性。MTS法檢測ME2小分子抑制劑對腫瘤細(xì)胞增殖的影響。分析ME2小分子抑制劑與ME2之間的構(gòu)效關(guān)系。通過研究ME2小分子抑制劑對酶動力學(xué)的影響，確定抑制劑的抑制類型

4、。
　　結(jié)果:我們在體外表達(dá)純化得到純度較高的人源ME2-His融合蛋白。建立了Z'因子為0.775，性噪比為9.83的ME2小分子抑制劑的高通量篩選體系。對國家新藥篩選中心化合物庫中的320，000個化學(xué)合成的小分子化合物和網(wǎng)絡(luò)藥物發(fā)現(xiàn)平臺的12，683個天然產(chǎn)物（含中藥有效成分）進(jìn)行篩選，獲得了105個對ME2有抑制作用的化合物。通過熱位移分析方法和向篩選體系中加入表面活性劑驗(yàn)證活性化合物的特異性，獲得了28個ME2小分子抑制

5、劑，其中12個來源于天然產(chǎn)物。12個天然產(chǎn)物來源的ME2小分子抑制劑中有4個化合物對腫瘤細(xì)胞增殖有抑制作用，其中CAS0006-E009對A549、MCF7、K562、HL-60、HCT-15、8226的IC50分別為34.13μmol/L,38.08μmol/L,49.11μmol/L、18.97μmol/L,74.94μmol/L，19.9μmol/L。對CAS0006-E009進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，獲得了16個結(jié)構(gòu)類似物。16個結(jié)構(gòu)類似物

6、中有5個化合物對ME2的IC50小于20μmol/L。5個結(jié)構(gòu)類似物中只有1個化合物——NPD389對A549、HCT-116的增殖均有較好的抑制作用，其在處理細(xì)胞72小時后的IC50分別為31.45μmol/L、11.55μmol/L，而且NPD389能時間依賴性地抑制HCT-116的增殖。得出了ME2小分子抑制劑與ME2之間的構(gòu)效關(guān)系。分子水平的作用機(jī)制研究表明NPD389為快結(jié)合抑制劑，其抑制類型為混合型中的非競爭-競爭性抑制劑。