TET1酶促核酸堿基羥基化：機制與中藥小分子調(diào)控作用.pdf

1、目的:
　　本課題旨在探討TET1酶催化的核酸堿基的羥基化的化學機制，并研究9種中藥小分子對其調(diào)控作用。
　　方法:
　　本課題以Fe2+和α-KG依賴的TET1酶為研究對象，分別以5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)、苯、甲苯、DMSO、d6-DMSO為底物;H2O、H2O18、18O2、D2O為反應(yīng)體系，通過GC-MS，UPLC-MS檢測方法探索TET1酶促核酸堿基羥基化的機制及羥基化產(chǎn)物·O

2、H中的O、H的來源。并用GC-MS檢測方法檢測原花青素(Proanthocyanidin，PC)、蟛蜞菊內(nèi)酯(Wedelolactone)、丹酚酸B(Salvianolic acid B)、槲皮苷(Quercetin-3-rhamnoside)、黃芩苷(Baicalin)、7，8-二羥基黃酮(7，8-dihydroxyflavone)、木犀草素(Luteolin)、氯化矢車菊素(Cyanidin Chloride)、花旗松素(Taxif

3、olin)9種中藥小分子化合物與5mC反應(yīng)后在N-甲基-N-三甲硅基三氟乙酰胺(N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide，MSTFA)衍生化試劑作用下產(chǎn)生的5hmC水平。
　　結(jié)果:
　　結(jié)果顯示:通過GC-MS檢測到TET1酶催化5mC羥基化產(chǎn)物5hmC。TET1酶催化苯并未產(chǎn)生羥基化產(chǎn)物苯酚的分子離子峰（m/z94）。甲苯、DMSO、d6-DMSO在TET1酶催化作用下分

4、別產(chǎn)生羥基化產(chǎn)物苯甲醇(m/z108)，C2H68O2(m/z94)，C2D68O2(m/z100)。在H2O18、18O2的反應(yīng)體系中，檢測到TET1催化5mC的羥基化產(chǎn)物C5H7N3OO18，而在D2O的反應(yīng)體系并未檢測到C5H6N3O2D。中藥小分子與5mC以1∶10摩爾比反應(yīng)時，原花青素、蟛蜞菊內(nèi)酯、丹酚酸B、黃芩苷、槲皮苷、7，8-二羥基黃酮、木犀草素、氯化矢車菊素、花旗松素、9種中藥天然活性成分對TET1酶催化5mC產(chǎn)生5h

5、mC峰面積分別為1053811，842578，794099,1277581,640249,555535,408748,0。
　　結(jié)論:
　　第一，TET1酶促5mC羥基化產(chǎn)生5hmC。TET1催化核酸堿基羥基化過程是從底物中的-CH3抽H原子，隨后H原子與TET1結(jié)合成·OH，羥基再“反彈”(Rebound)到底物-CH2。在此過程中，·OH中的H來源于底物中的-CH3上的H，并非來源H2O中的H。而·OH中的O可能是來源于