Tet1介導(dǎo)的DNA去甲基化在膽紅素致體外神經(jīng)元損傷中的機(jī)制研究.pdf

1、目的：通過建立大鼠神經(jīng)元膽紅素（Bilirubin,Bil）體外模型，觀察Bil對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞活力、氧化損傷、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶3（Caspase-3）活性及DNA去甲基化轉(zhuǎn)移酶（Tet1）和Klotho基因蛋白和mRNA水平變化的影響，探討B(tài)il通過氧化應(yīng)激引起Tet1介導(dǎo)的DNA去甲基化在神經(jīng)元損傷中的作用機(jī)制，為高膽紅素血癥致神經(jīng)元損傷的機(jī)理研究提供新的思路與方法。
　　方法：（1）采用0.025％的胰蛋白酶消化SD

2、乳鼠（出生24h以內(nèi)）腦組織分離出神經(jīng)元，無(wú)血清神經(jīng)元特異性培養(yǎng)基Neurobasal培養(yǎng)單純的神經(jīng)元；（2）37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)神經(jīng)元72h后，給予低、中、高濃度的Bil（分別為25、50、100μmol/L）處理，在Bil作用4、8、12、24h后，通過MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性；（3）Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒及活性氧（ROS）檢測(cè)試劑盒（DCFH-DA探針法）分別檢測(cè)培養(yǎng)72h，并對(duì)不同濃度Bil作用24h后的神經(jīng)元Ca

3、spase-3活性和ROS總量水平；（4）蛋白免疫印跡（Western blot）和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法分別測(cè)定培養(yǎng)72h并用不同濃度Bil作用24h后各組神經(jīng)元中Tet1和Klotho基因的蛋白質(zhì)表達(dá)與mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果：（1）經(jīng)過特異性培養(yǎng)基培養(yǎng)72h后，可以獲得單一的神經(jīng)元；（2）MTT結(jié)果顯示：神經(jīng)元培養(yǎng)72h并用不同濃度Bil作用4h后，與對(duì)照組相比較，各組神經(jīng)元細(xì)胞活性均未出現(xiàn)顯著性降低（P＞

4、0.05）；Bil作用時(shí)間增加至8h時(shí)，與對(duì)照組相比較高濃度組神經(jīng)元活性出現(xiàn)了顯著性降低（P＜0.01）；Bil作用12h后，神經(jīng)元活性的變化與8h相同（P＜0.01）；但是當(dāng)Bil作用24h后，與對(duì)照組相比較，中濃度與高濃度Bil均能顯著性降低神經(jīng)元活性（P＜0.05，P＜0.01）；（3）Caspase-3活性檢測(cè)結(jié)果顯示：神經(jīng)元培養(yǎng)72h并用不同濃度Bil作用24h后，與對(duì)照組相比較，低、中、高濃度Bil均會(huì)引起神經(jīng)元中Caspa

5、se-3活性升高（P＜0.01）；（4）ROS檢測(cè)結(jié)果顯示：神經(jīng)元培養(yǎng)72h并用不同濃度Bil作用24h后，與對(duì)照組比較，在熒光顯微鏡下觀察，各濃度Bil均可引起神經(jīng)元中ROS的相對(duì)含量顯著性升高（P＜0.01）；（5）Western blot結(jié)果顯示：神經(jīng)元培養(yǎng)72h并用不同濃度Bil作用24h后，與對(duì)照組相比，低、中、高濃度組Tet1蛋白表達(dá)水平均出現(xiàn)了顯著性降低（P＜0.01）；與對(duì)照組相比，低、中濃度組Klotho蛋白表達(dá)水平也

6、均出現(xiàn)顯著性降低（P＜0.05），并且高濃度組Klotho蛋白表達(dá)水平降低更明顯（P＜0.01）；RT-PCR結(jié)果顯示：與對(duì)照組比低濃度Bil組神經(jīng)元中Tet1和Klotho mRNA表達(dá)水平出現(xiàn)了降低（P＜0.05），同時(shí)中、高濃度Bil組的Tet1和Klotho mRNA表達(dá)降低更顯著（P＜0.01）。
　　結(jié)論：神經(jīng)元培養(yǎng)72h并且Bil作用24h后，高濃度Bil能顯著性的降低神經(jīng)元的活性，增加神經(jīng)元內(nèi)ROS的含量，增強(qiáng)Ca