N-乙酰半胱氨酸對BDE-209致新生鼠海馬神經(jīng)元氧化損傷的影響及初步探討B(tài)DE-209對海馬神經(jīng)元DNA甲基化水平的影響.pdf

1、多溴聯(lián)苯醚（Plybrominated diphenyl ethers,PBDEs）是一些類含溴原子的芳香族化學(xué)物，從20世紀(jì)80年代起，人們發(fā)現(xiàn)阻燃劑多氯聯(lián)苯（Polychlorinated biphenyl，PCBs）對人體健康有害，而PBDEs的化學(xué)結(jié)構(gòu)與PCB相似，具有相似的阻燃作用，故作為多氯聯(lián)苯（PCBs）的替代品，被廣泛地應(yīng)用在各種消費(fèi)品種中。但PBDEs與PCBs一樣是一種持續(xù)的環(huán)境有機(jī)污染物。隨著工業(yè)的發(fā)展，PBDEs

2、在世界范圍的需求不斷增加，環(huán)境中的PBDEs的濃度也逐年增多，已高于PCBs在環(huán)境中的濃度。PBDEs可沉積在水體和土壤中，并通過食物鏈，進(jìn)入動物和人體。在人體的乳汁、脂肪、血液、肝臟等器官中均可檢測出PBDEs。PBDEs的急性毒性很低，口服的半數(shù)致死量為>5g/kg。而慢性暴露在PBDEs時(shí)，其作用的靶器官為肝臟、腎臟、甲狀腺、神經(jīng)系統(tǒng)等。目前國內(nèi)外對低溴聯(lián)苯醚的相關(guān)毒性研究較多，而且較肯定。從大量動物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)PBDEs可能具有肝

3、毒性、生殖毒性、甲狀腺毒性、神經(jīng)發(fā)育毒性及潛在的致癌性等。因此，在歐盟及美國已禁止使用，十溴聯(lián)苯醚(decabrominated BDE,BDE-209或DeBDE)的毒性較低溴聯(lián)苯醚類低，在美國及歐洲仍允許生產(chǎn)使用。而我國不但是PBDEs的生產(chǎn)、使用和出口大國，其中十溴聯(lián)苯醚（BDE-209）的生產(chǎn)使用量最大，而且還是接收電子垃圾的大國。BDE-209已成為我國重要的環(huán)境污染物。因此，我們深入對十溴聯(lián)苯醚（BDE-209）的研究有一定

4、的迫切性和必要性。
　　 我們的研究小組在前期實(shí)驗(yàn)中，對原代胎鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行BDE-209染毒后，發(fā)現(xiàn)在一定劑量的BDE-209作用下，原代胎鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞可發(fā)生凋亡及氧化損傷，并存在一定得劑量-反應(yīng)關(guān)系，推測氧化應(yīng)激可能是BDE-209引起神經(jīng)毒性的重要機(jī)制之一。但目前BDE-209是如何導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降的機(jī)制仍不清楚，有否基因毒性仍不明確。
　　 本課題主要在細(xì)胞水平上研究抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸（NAC

5、）對BDE-209致原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷的影響以及初步研究BDE-209對原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細(xì)胞整體DNA水平甲基化的影響。DNA甲基化是一種基因表達(dá)調(diào)控的重要機(jī)制，在很多毒物毒性及疾病中起重要作用；正常DNA甲基化對于中樞神經(jīng)功能具有重要意義，異常DNA甲基化狀態(tài)與腫瘤、智力發(fā)育遲緩、免疫缺陷等疾病有一定的相關(guān)；對DNA甲基化狀態(tài)的正確評估，有助于我們對BDE-209毒理機(jī)制的深入了解。本課題主要分為以下三部分：
　　

6、 第一部分N-乙酰半胱氨酸對BDE-209致新生鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)改變的影響
　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　 取新生24小時(shí)內(nèi)的SD大鼠海馬組織進(jìn)行原代神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)，鑒別神經(jīng)元的純度，觀察N-乙酰半胱氨酸對BDE-209引起原代培養(yǎng)新生鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變及細(xì)胞存活率下降的影響。
　　 材料與方法:
　　 1.購買新生24小時(shí)內(nèi)的SD大鼠，取海馬組織進(jìn)行原代神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)。
　　 2.培養(yǎng)7天

7、后海馬神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)元細(xì)胞純度鑒別。
　　 3.原代培養(yǎng)7天的新生鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞分成11組，即對照組和實(shí)驗(yàn)組，對照組分為空白對照組（含有含1‰DMSO的培養(yǎng)液）和NAC對照組（含有0.1mmol/L NAC的培養(yǎng)液）。實(shí)驗(yàn)組分成I組（BDE-209單獨(dú)染毒組）、II組（BDE-209與NAC同時(shí)作用）及III組（NAC先作用24小時(shí)后，BDE-209再染毒），各大組中均含有3個(gè)濃度的BDE-209小組，BDE-209濃度分

8、別為10、30、50ug/ml。NAC濃度均為0.1mmol/L。每組設(shè)3個(gè)平行樣，實(shí)驗(yàn)重覆3次。染毒24h后，在倒置顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察。
　　 4.MTT比色分析檢測神經(jīng)元的存活率。
　　 結(jié)果:
　　 1.原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)第7天觀察神經(jīng)元細(xì)胞生長良好，胞體較大，胞突主干和分枝明顯延長并增粗，其突起形成稠密的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。
　　 2.免疫細(xì)胞化學(xué)法NeuN鑒定神經(jīng)元的經(jīng)典方法。由結(jié)果可見分散的海

9、馬神經(jīng)元，神經(jīng)元是主體，可占95％。
　　 3.倒置顯微鏡觀察不同實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)，在實(shí)驗(yàn)I組中的10ug/ml組、30ug/ml組、50ug/ml組中可見神經(jīng)元細(xì)胞胞體有所變小，變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，隨著染毒劑量加大，發(fā)泡現(xiàn)象明顯，其神經(jīng)突起出現(xiàn)縮短，在50ug/ml組中可見有細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落，突起縮短甚至消失。在實(shí)驗(yàn)II組與III組中均可見神經(jīng)元細(xì)胞胞體變形現(xiàn)象、細(xì)胞膜發(fā)泡現(xiàn)象有所減少，實(shí)驗(yàn)II組與II

10、I組之間的細(xì)胞形態(tài)無明顯差異。
　　 4.MTT比色分析檢測神經(jīng)元的存活率，隨BDE-209濃度增加，神經(jīng)元細(xì)胞的存活率明顯下降 (P<0.05)，II組及III組中的神經(jīng)元細(xì)胞存活率均有所升高，但I(xiàn)II組的神經(jīng)元細(xì)胞存活率與I組比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。在II組與I組的細(xì)胞存活率比較，有明顯增高（P<0.05），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 BDE-209可引起原代培養(yǎng)新生鼠海馬

11、神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)改變、細(xì)胞存活率下降，這與BDE-209有一定量效關(guān)系，NAC能改善BDE-209對海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞存活率的影響，NAC的拮抗作用是與BDE-209和NAC的濃度及作用時(shí)間有關(guān)。
　　 第二部分N-乙酰半胱氨酸對BDE-209致新生鼠海馬神經(jīng)元氧化損傷的影響
　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　 觀察N-乙酰半胱氨酸對BDE-209致新生鼠海馬神經(jīng)元氧化損傷的影響。
　　 材料與方法:
　　

12、 1.原代培養(yǎng)7天的新生鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞，分成8組，即對照組和實(shí)驗(yàn)組，即對照組和實(shí)驗(yàn)組，對照組分為空白對照組（含有含1‰DMSO的培養(yǎng)液）和NAC對照組（含有0.1mmol/LNAC的培養(yǎng)液）。實(shí)驗(yàn)組為I組及II組，I組為BDE-209單獨(dú)染毒組，其中分3個(gè)濃度小組，分別為10 ug/ml組、30 ug/ml組及50ug/ml組，II組為BDE-209與NAC同時(shí)作用組，也分為3個(gè)濃度小組，分別為10ug/ml組、30ug/ml組及5

13、0ug/ml，NAC濃度均為0.1mmol/L。染毒24小時(shí)后取細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行檢測。
　　 2.采用黃嘌呤氧化法測定SOD活力。
　　 3.采用硫代巴比妥酸法測定MDA含量。
　　 4.采用硝酸還原酶法測定NO含量。
　　 結(jié)果:
　　 1.隨濃BDE-209濃度的增加，在BDE-209單獨(dú)染毒組及與NAC同時(shí)作用組中，SOD活力均有明顯下降（P<0.05）。與NAC同時(shí)作用實(shí)驗(yàn)組中的SOD活力比

14、BDE-209單獨(dú)染毒組中的SOD活力高，并有明顯差異性（P<0.05）
　　 2.在BDE-209單獨(dú)染毒組中，隨BDE-209濃度增加，MDA含量逐漸增加，30ug/ml組及50ug/ml組與對照組比較，均有明顯差異性（P<0.05），在BDE-209單獨(dú)染毒組及與NAC同時(shí)作用組之間比較，與NAC同時(shí)作用實(shí)驗(yàn)組中的MDA含量比BDE-209單獨(dú)染毒組中MDA含量低，有明顯差異性（P<0.05）。
　　 3.在BDE

15、-209單獨(dú)染毒組中，隨BDE-209濃度增加，NO含量均有明顯增加（P<0.05），三個(gè)濃度組間相比無明顯差異性（P>0.05），在BDE-209單獨(dú)染毒組及與NAC同時(shí)作用組之間比較，與NAC同時(shí)作用實(shí)驗(yàn)組中的NO含量比BDE-209單獨(dú)染毒組低，有明顯差異性（P<0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 BDE-209能引起海馬神經(jīng)元細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，這可能是BDE-209的神經(jīng)毒性的機(jī)制之一。而一定濃度的NAC能改善一定

16、濃度的BDE-209引起的氧化損傷。
　　 第三部分BDE-209對原代培養(yǎng)新生鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞整體DNA甲基化水平的影響
　　 目的:
　　 檢測BDE-209對原代培養(yǎng)新生鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞整體DNA甲基化水平，以探討B(tài)DE-209對海馬神經(jīng)元細(xì)胞影響的作用機(jī)制。
　　 材料與方法:
　　 1.原代培養(yǎng)7天的新生鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞分5組，即對照組和實(shí)驗(yàn)A、B、C組（含BDE-209濃度分別為10、3

17、0、50ug/ml），對照組又分為完全空白對照組及用1‰DMSO染毒的對照組。每組設(shè)3個(gè)平行樣，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
　　 2.提取細(xì)胞DNA。
　　 3.采取酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行整體DNA甲基化定量分析。
　　 結(jié)果:
　　 BDE-209染毒后，均引起整體DNA甲基化水平下降，其中10ug/ml組及30ug/ml組與空白組對比，有明顯差異性（P<0.05），10ug/ml組與DMSO對照組相比也有明顯的差異性