n-乙酰半胱氨酸對(duì)甲基汞致大鼠腦氧化損傷和谷氨酸代謝障礙的影響.pdf

1、甲基汞(methylmereury, MeHg)是一種有毒化合物，引起的環(huán)境污染已成為全球性問(wèn)題，并受到世界各國(guó)研究者的極大關(guān)注。由于甲基汞具有脂溶性的特點(diǎn)，易于穿透生物膜，在生物體中大量積累，具有很高的穩(wěn)定性，并在組織中長(zhǎng)期存在，難以消除，對(duì)環(huán)境具有生物蓄積毒性作用。甲基汞中毒是以神經(jīng)系統(tǒng)為主的全身性損害，在日本曾經(jīng)由于水體甲基汞的污染導(dǎo)致了水俁病的發(fā)生。目前對(duì)甲基汞致神經(jīng)毒性的機(jī)制尚不清楚，有相關(guān)報(bào)道稱(chēng)與大腦內(nèi)谷氨酸的代謝轉(zhuǎn)運(yùn)障礙及

2、氧化損傷有關(guān)，二者的相互作用又進(jìn)一步增大了神經(jīng)毒性。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)是半胱氨酸的衍生物，它的巰基可作為H+供體而發(fā)揮直接的抗氧化作用，而且能再合成具有生物活性的谷胱甘肽，從而起到間接抗氧化作用及自由基清除作用，因而在臨床和實(shí)驗(yàn)中有著廣泛的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)研究將通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)建立MeHg亞急性中毒模型，并應(yīng)用NAC進(jìn)行預(yù)處理。在研究MeHg所致氧化損傷作用和興奮性神經(jīng)毒性作用的同時(shí)觀察NAC對(duì)Me

3、Hg所致神經(jīng)毒性是否具有拮抗作用，從而更加深入地探討MeHg所致氧化損傷與興奮性神經(jīng)毒性之間的內(nèi)在聯(lián)系，為MeHg中毒的防治提供新的思路。
　　 材料與方法:
　　 由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的清潔級(jí)Wistar大鼠72只，體重180±10g，雌雄各半，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):SYXK（遼）2003-0013。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室溫度17-23℃，相對(duì)濕度45-55％，普通光照，動(dòng)物飼料由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。正式實(shí)驗(yàn)前飼養(yǎng)1周，按體重

4、隨機(jī)分成4組，每組18只，雌雄各半。第1組為對(duì)照組，第2、3組分別為低、高劑量單純?nèi)炯谆M，第4組為NAC預(yù)處理組。對(duì)照組和單純?nèi)炯谆M皮下注射生理鹽水，NAC預(yù)處理組皮下注射1mmol/kg NAC;2h后，對(duì)照組腹腔注射生理鹽水，低、高劑量單純?nèi)炯谆M分別腹腔注射4μmol/kg、12μmol/kg CH3HgCl，NAC預(yù)處理組腹腔注射12μmol/kg CH3HgCl，干預(yù)與染毒劑量均為5ml/kg。連續(xù)染毒4周，每周5次

5、，共20次;隔日干預(yù)1次，每周3次，共12次。每周測(cè)量并記錄大鼠的體重。最后一次染毒24h后，每組取6只大鼠腹腔注射10％水合氯醛溶液麻醉，劑量均為5ml/kg，心臟放血處死，迅速開(kāi)顱取出完整大腦，冰浴下切取枕葉大腦皮質(zhì)，并根據(jù)檢測(cè)指標(biāo)的不同，制備成相應(yīng)的勻漿液待用，測(cè)定汞、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、蛋白巰基(-SH)、羰基（-C=O-）、谷氨酸(Glu)和谷氨酰胺(Gln)的含量，及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化

6、物酶(GSH-Px)、谷氨酰胺酶(PAG)、谷氨酰胺合成酶(GS)、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶的活力;再取各組4只大鼠麻醉后心臟放血處死，于冰浴下切取枕葉大腦皮質(zhì)，制備單細(xì)胞懸液待用，測(cè)定ROS含量、細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度及細(xì)胞凋亡壞死率;另取6只大鼠麻醉后心臟放血處死用于檢測(cè)NMDA受體(NR1、NR2A、NR2B)、谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(GLAST、GLT-1)和Nrf2及下游基因（HO-1、γ-GCSh、Gpx-1）的mRNA

7、和蛋白表達(dá);各組其余2只大鼠麻醉后，解剖胸腔，暴露心臟，4％多聚甲醛磷酸緩沖液左心室灌流用于固定大腦組織，進(jìn)行免疫組化反應(yīng)檢測(cè)8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷(8-OHdG)的含量及光鏡、電鏡形態(tài)學(xué)觀察。
　　 結(jié)果:
　　 對(duì)照組大鼠一般狀況良好，染甲基汞組大鼠體重增長(zhǎng)較對(duì)照組明顯緩慢;隨著染汞劑量的增大，腦皮質(zhì)汞的含量也隨之增大，GSH、Gln、-SH的含量和NR1、NR2A、GLAST、GLT-1、Gpx-1的mRNA和蛋白表達(dá)水

8、平降低(P＜0.05，P＜0.01)，MDA、-C=O-、Glu、ROS、8-OHdG的含量和Nrf2、HO-1、γ-GCSh的mRNA和蛋白表達(dá)水平升高(P＜0.05，P＜0.01)，SOD、GSH-Px、GS、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶的活力降低(P＜0.05，P＜0.01)，PAG的活力升高(P＜0.05，P＜0.01)，細(xì)胞內(nèi)Ca+濃度和細(xì)胞凋亡壞死率增大(P＜0.05，P＜0.01)，形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞出現(xiàn)病理學(xué)損

9、傷;NAC預(yù)處理組與高劑量染汞組比較，上述指標(biāo)均得到不同程度的改善(P＜0.05，P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1、甲基汞可致大鼠腦皮質(zhì)GSH、-SH的含量和Gpx-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平降低，MDA、-C=O-、ROS、8-OHdG的含量和Nrf2、HO-1、γ-GCSh的mRNA和蛋白表達(dá)水平升高，SOD、GSH-Px、Na+-K-ATP酶、Ca2+-ATP酶的活力降低，對(duì)大鼠腦產(chǎn)生氧化損傷;同時(shí)又可致G