低劑量BDE-209單獨和與BDE-47聯(lián)合暴露對體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)干細胞形態(tài)學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)的影響.pdf

1、【背景】
　　1.多溴聯(lián)苯醚（Polybrominated Diphenyl Ethers，PBDEs）
　　多溴聯(lián)苯醚(Polybrominated Diphenyl Ethers，PBDEs)是一類溴代化合物，由于阻燃效率高、成本較低常作為阻燃劑添加到樹脂、油漆、聚氨酯泡沫和聚苯乙烯等高分子合成材料中，廣泛地應(yīng)用于紡織品、塑料制品、電子電器和建筑材料等領(lǐng)域。早在1960年開始生產(chǎn)和使用多溴聯(lián)苯醚，直到1981年瑞典發(fā)現(xiàn)多

2、溴聯(lián)苯醚是一種環(huán)境污染物。多溴聯(lián)苯醚現(xiàn)已成為全球環(huán)境中普遍存在的污染物。有資料顯示,大概80％的電子洋垃圾被運送到中國、印度等亞洲國家，而運送到中國的就占了90%。
　　由于多溴聯(lián)苯醚和多氯聯(lián)苯醚（PCBs）具有相似的特征：難降解性、環(huán)境穩(wěn)定性、高脂溶性、遠距離遷移性和生物放大效應(yīng)，能通過食物鏈傳播，通過食物、大氣、母乳和室內(nèi)灰塵等在人體內(nèi)蓄積，最終可危害人類的健康。PBDEs作用的主要靶器官是神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、脂肪組織和甲狀腺

3、等。動物實驗證實多溴聯(lián)苯醚有神經(jīng)發(fā)育毒性、生殖毒性、免疫毒性和內(nèi)分泌干擾毒性及潛在的致癌性。因此,在歐美等國家已限制生產(chǎn)和使用低溴類PBDEs，但一些高溴類PBDEs，如BDE-209因其阻燃性好，生物毒性不確切而仍被廣泛使用。目前人們對PBDEs毒性的了解還遠不如PCBs。實驗室研究證據(jù)積累相對較多，而人群研究的對象主要是職業(yè)人群，數(shù)據(jù)相對缺乏。職業(yè)不同的人群中PBDEs同系物的分布也不相同。對中國、荷蘭、美國及瑞士人群調(diào)查發(fā)現(xiàn)，非職

4、業(yè)暴露人群體內(nèi)主要為BDE-153，職業(yè)暴露人群體內(nèi)主要為BDE-209和BDE-183。在現(xiàn)實環(huán)境中，多種污染物是同時存在，同時起作用。
　　2.十溴聯(lián)苯醚（BDE-209）及四溴聯(lián)苯醚（BDE-47）
　　十溴聯(lián)苯醚（BDE-209）是一種含有十個溴原子的多溴聯(lián)苯醚，具有穩(wěn)定性好，添加量少，價格便宜等優(yōu)勢，我國不僅是PBDEs的生產(chǎn)、使用和出口大國，而且還是接收電子垃圾的大國，其中BDE-209的生產(chǎn)使用量最大，因此BD

5、E-209已成為我國重要的環(huán)境污染物。BDE-209在生產(chǎn)、使用和廢物處理過程中通過一系列遷移轉(zhuǎn)化進入沉積物、大氣、生物固體及生物體中。進入生物體后，十溴聯(lián)苯醚可代謝為低溴聯(lián)苯醚、多溴二苯并呋喃及溴二苯并二噁英，引起更強的毒性效應(yīng)。研究證明BDE-209具有神經(jīng)發(fā)育毒性、肝臟毒性、甲狀腺毒性、生殖毒性以及致癌性；母體內(nèi)的BDE-209也可通過胎盤及乳汁傳遞給胎兒。但也有學(xué)者認為BDE-209在體內(nèi)的代謝快，蓄積低，在常規(guī)暴露水平下對機體

6、不造成影響。鑒于此，對于BDE-209的生物毒性的進一步研究是很有必要的。
　　四溴聯(lián)苯醚（BDE-47）也是PBDEs的主要同系物之一，與BDE-209同是近年環(huán)境中含量增長較快的持久性環(huán)境有機污染物。有研究報道示珠三角土壤中PBDEs污染嚴(yán)重，含量較高主要是BDE-209，BDE-47次之。由于BDE-209作為高溴化合物在體內(nèi)代謝時可轉(zhuǎn)化為BDE-47，轉(zhuǎn)化過程中二者比例可發(fā)生不同變化。也有研究發(fā)現(xiàn)，BDE-209的作業(yè)人群

7、體內(nèi)存在高含量的BDE-209和相對較低含量BDE-47，停止暴露三年后，血樣本中BDE-209的含量顯著下降，但BDE-47含量并未發(fā)生明顯改變，這一變化對生物體影響正是我們要關(guān)注的焦點。因此，開展BDE-209與BDE-47聯(lián)合暴露對生物體影響的研究十分必要。
　　3.神經(jīng)干細胞(neural stem cell，NSCs)
　　神經(jīng)干細胞(NSCs)是干細胞的一種，是存在于腦和脊髓中未分化的細胞，與其他干細胞一樣，神經(jīng)

8、干細胞也具有自我更新、分裂增殖及多樣分化的特點，它能夠分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞等多種類型的神經(jīng)細胞，屬于專能干細胞。神經(jīng)干細胞的發(fā)現(xiàn)，為中樞神經(jīng)性的重建和神經(jīng)的再生提供了一個新的思路，為學(xué)習(xí)記憶機制的研究提供了一個新的視點。在哺乳動物胚胎期，神經(jīng)干細胞主要分布在海馬、嗅球、小腦、大腦皮質(zhì)、腦室下區(qū)和側(cè)腦室(室管膜上皮)；在成年后主要存在于海馬、紋狀體、腦室區(qū)、腦室下區(qū)及嗅球等部位。目前，NSCs研究的核心問題是NSCs增

9、殖和分化的調(diào)控，研究表明，NSCs的增殖及分化的調(diào)控受多種因素的影響，有外源性因素(細胞因子和微環(huán)境)和內(nèi)源性因素(基因)共同調(diào)控，其中起著決定作用的是內(nèi)源性因素。
　　個體發(fā)育是由干細胞不斷分化形成功能細胞的過程，而神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育也是胚胎干細胞不斷分化成神經(jīng)干細胞、再分化成神經(jīng)細胞的過程，這分化過程任何一環(huán)節(jié)受影響均可導(dǎo)致神經(jīng)元數(shù)目減少，從而引起神經(jīng)功能缺陷。腦是由神經(jīng)干細胞經(jīng)過不斷增殖、分化而最終形成。神經(jīng)干細胞通過對稱分裂進行

10、自我更新，維持細胞種群，通過不對稱分裂完成細胞分化，而外來化學(xué)物能夠影響神經(jīng)干細胞的自我更新潛能和發(fā)育分化的方向選擇。
　　4.蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics）
　　蛋白質(zhì)組(Proteome)是指一種細胞或一個組織基因組所表達的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics）是以基因組編碼的所有蛋白質(zhì)為研究對象，從細胞水平及整體水平研究蛋白質(zhì)的組成及其變化規(guī)律，從而深入認識有機體的多種病理生理過程。蛋白質(zhì)組學(xué)一詞源于蛋白質(zhì)

11、（protein）與基因組學(xué)（genomics）兩個詞的組合，意指“一種基因組所表達的全套蛋白質(zhì)”，即包括一種細胞乃至一種生物所表達的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組本質(zhì)上指的是在大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)的特征，包括蛋白質(zhì)的表達水平，翻譯后的修飾，蛋白與蛋白相互作用等，由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于疾病發(fā)生，細胞代謝等過程的整體而全面的認識，這個概念最早是由Marc Wilkins在1995年提出的。因此，蛋白質(zhì)組學(xué)研究不僅是探索生命奧秘的必須工作，也能

12、為人類健康事業(yè)帶來巨大的利益。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究是生命進入后基因時代的特征。
　　由于NSCs分化過程中有眾多的蛋白質(zhì)、細胞因子的參與和消失,探索其功能和機制的過程是極其復(fù)雜和龐大的,而蛋白質(zhì)組學(xué)具有規(guī)模大和高通量等優(yōu)點,與基因組學(xué)、生物信息學(xué)互相滲透、互相補充。PBDEs可影響NSCs的增殖和分化，但是其影響機制尚未完全闡明，因而本課題從細胞水平,給予體外培養(yǎng)神經(jīng)干細胞低劑量BDE-209及BDE-47聯(lián)合暴露，研究BDE-209

13、及BDE-47聯(lián)合暴露對神經(jīng)干細形態(tài)學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)的影響，以更全面地了解BDE-209及BDE-47神經(jīng)發(fā)育毒性的影響關(guān)鍵點，更深入地了解PBDEs與先天神經(jīng)發(fā)育異常的關(guān)系，為臨床上對PBDEs引起的神經(jīng)發(fā)育異常進行有效地檢測和預(yù)防提供理論依據(jù)。本課題分為以下兩個部分進行各項具體實驗。
　　第一部分低劑量BDE-209單獨和與BDE-47聯(lián)合暴露對體外培養(yǎng)神經(jīng)干細胞的形態(tài)學(xué)的影響
　　【目的】
　　取24小時內(nèi)新生SD

14、大鼠的海馬組織進行無血清傳代培養(yǎng)，對神經(jīng)干細胞進行鑒定和純度檢測，染毒后分別測量形成神經(jīng)球數(shù)目及神經(jīng)球直徑，觀察BDE-209單獨和與BDE-47聯(lián)合暴露對體外培養(yǎng)新生鼠海馬神經(jīng)干細胞形態(tài)的影響。
　　【材料與方法】
　　1.購買清潔級24小時內(nèi)新生SD大鼠，取大鼠海馬組織進行體外神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)。
　　2.對培養(yǎng)3-4代后的海馬神經(jīng)干細胞進行鑒定及純度檢測。
　　3.將傳代培養(yǎng)3-4代的新生鼠海馬神經(jīng)干細胞吹打

15、成單細胞懸液，之后進行BDE-209及BDE-47染毒，實驗共分8組：對照組（DMSO），0.6 ug/ml BDE-209組，1.0 ug/ml BDE-209組，6.0 ug/ml BDE-209組，3.2ug/ml BDE-47組，0.6ug/ml BDE-209+3.2ug/ml BDE-47組，1.0ug/ml BDE-209+3.2ug/ml BDE-47組，6.0ug/ml BDE-209+3.2ug/ml BDE-47組

16、，每組設(shè)5個平行樣。對照組加入含1‰DMSO的培養(yǎng)液。
　　4.染毒72h后，在倒置顯微鏡下進行神經(jīng)干細胞形態(tài)觀察，利用圖象分析軟件記錄形成神經(jīng)球的個數(shù)，測量神經(jīng)球的平均直徑。
　　【結(jié)果】
　　1.神經(jīng)干細胞鑒定：海馬組織經(jīng)培養(yǎng)3～5天可見神經(jīng)球形成,之后可見神經(jīng)球逐漸增大，經(jīng)免疫細胞化學(xué)染色，神經(jīng)干細胞的標(biāo)記性蛋白巢蛋白(Nestin)表達陽性，證實所分離培養(yǎng)的細胞是神經(jīng)干細胞。
　　2.海馬神經(jīng)干細胞培養(yǎng)3

17、～4代后在倒置顯微鏡下觀察，由數(shù)十到數(shù)百個細胞聚集形成大小不等的神經(jīng)球，表面可見單細胞突出呈魚泡狀，折光性強，周圍光暈明顯，吹打成單細胞懸液后行免疫細胞化學(xué)法對神經(jīng)干細胞的純度進行檢測。由結(jié)果可見分散的神經(jīng)干細胞占主體,可占90%以上。
　　3.利用圖象分析軟件記錄形成神經(jīng)球的個數(shù)，測量神經(jīng)球的平均直徑，發(fā)現(xiàn)低劑量BDE-209染毒組(0.6 ug/ml BDE-209組)形成神經(jīng)球個數(shù)與對照組無顯著差異。隨著染毒劑量的增加，神經(jīng)

18、球數(shù)目變少。還發(fā)現(xiàn)低劑量BDE-209染毒組(0.6 ug/ml BDE-209組和1.0 ug/ml BDE-209)形成神經(jīng)球直徑大小與對照組無顯著差異。BDE-209和BDE-47聯(lián)合染毒對形成神經(jīng)球個數(shù)的影響存在交互作用(P<0．05)。
　　【結(jié)論】
　　以上提示：無血清培養(yǎng)的新生鼠海馬組織神經(jīng)干細胞具有自我更新和增殖能力，神經(jīng)干細胞形成懸浮生長的神經(jīng)球，經(jīng)免疫細胞化學(xué)鑒定所培養(yǎng)的是神經(jīng)干細胞。一定劑量的BDE-2

19、09和BDE-47可導(dǎo)致新生鼠海馬神經(jīng)干細胞形成神經(jīng)球數(shù)目及直徑改變，BDE-209與BDE-47之間對神經(jīng)干細胞的生長存在一定的交互作用。
　　第二部分低劑量BDE-209單獨和與BDE-47聯(lián)合暴露對體外培養(yǎng)神經(jīng)干細胞蛋白組學(xué)的影響
　　【目的】
　　采用蛋白質(zhì)組學(xué)研究BDE-209及BDE-47對神經(jīng)干細胞蛋白的影響，從蛋白質(zhì)水平探討PBDES神經(jīng)發(fā)育毒性機制。
　　【材料與方法】
　　1.傳代培養(yǎng)3

20、-4代的新生鼠海馬神經(jīng)干細胞暴露于BDE-209及BDE-47，實驗共分4組：（1）對照組（DMSO）；（2）6.0 ug/ml BDE-209組；（3）3.2 ug/mlBDE-47組；（4）6.0 ug/ml BDE-209+3.2 ug/mlBDE-47組。每組設(shè)5個平行樣。對照組加入含1‰DMSO的培養(yǎng)液。
　　2.染毒培養(yǎng)72h后，離心收集細胞，提取各組總蛋白質(zhì)，采用Bradford法測定蛋白質(zhì)樣品濃度。
　　3.

21、進行雙向凝膠電泳（2-DE）分離差異蛋白：第一向等電聚焦（IEF）；第二向SDS-PAGE.
　　4.凝膠染色：分析膠銀染，質(zhì)譜膠考染。
　　5.銀染后采用Powerlook1100掃描儀對染色后的雙向凝膠電泳膠進行掃描獲取圖像，采用Image Master2D platinum5.0凝膠圖像分析軟件進行分析識別差異表達的蛋白質(zhì)點。
　　6.對表達差異1.8倍以上蛋白質(zhì)點進行膠內(nèi)酶解和MALDI-TOF-MS檢測，獲得