柑橘胚胎發(fā)生過程中DNA甲基化-去甲基化研究及SSR標(biāo)記開發(fā).pdf

1、柑橘是一種重要的木本作物，充分利用各種分子標(biāo)記是柑橘育種的一個(gè)重要手 段。本研究主要進(jìn)行了兩種標(biāo)記在柑橘上的開發(fā)和利用。第一種是MSAP標(biāo)記的開發(fā)和利用。MSAP是一種AFLP與DNA甲基化相結(jié)合的標(biāo)記。DNA甲基化是DNA的一種重要修飾，在基因的表達(dá)調(diào)控中起了重要作用。通過愈傷組織再生是柑橘繁殖的一個(gè)重要途徑，在現(xiàn)代生物技術(shù)上有著非常廣泛的應(yīng)用。然而調(diào)控柑橘愈傷組織再生的一些關(guān)鍵性因素尚未研究清楚，為這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用帶來了諸多麻煩。本

2、研究旨在利用MSAP標(biāo)記篩選在愈傷組織再生過程中DNA甲基化的發(fā)生變化的位點(diǎn)，進(jìn)而研究DNA甲基化在再生過程中的變化規(guī)律，希望以此為突破口，了解DNA甲基化在愈傷再生過程中的作用。第二種是微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)。微衛(wèi)星標(biāo)記是一種已在柑橘育種上廣泛應(yīng)用的標(biāo)記，但目前可用的標(biāo)記和種類都比較有限。在這個(gè)研究中，嘗試?yán)蒙镄畔W(xué)，直接從序列數(shù)據(jù)庫中開發(fā)SSR標(biāo)記，并獲得了一定的成功。主要研究結(jié)果如下： 1.以伏令夏橙和山金柑為材料，分別建立

3、了來源于同一胚狀體的單胚系，并觀測了愈傷再生過程的畸形狀況。再生過程中畸形的主要有胚狀體發(fā)育畸形，子葉畸形和葉型，節(jié)間距、株型不正常。胚狀體在產(chǎn)生畸形植株的過程中，也能產(chǎn)生非畸 形植株；畸形植株在隨后的生長過程中還能恢復(fù)正常株型，具有一定的不均一性和可逆性。這和擬南芥上有關(guān)DNA甲基化導(dǎo)致的畸形有一定的相似性。 2.以來源于同一單胚系的愈傷、胚狀體、葉片以及長期繼代的愈傷為材料建立了一個(gè)山金柑MSAP試驗(yàn)體系。在PstI／Ms

4、eI酶切組合中篩選了40對(duì)引物，發(fā)現(xiàn)了53個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。在HpaII／EcoRI和MspI／EcoRI酶切組合中篩選了32對(duì)引物，一共發(fā)現(xiàn)了19個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。證明了這種方法可以用于再生過程中DNA甲基化分析。 3.這些多態(tài)性的帶表現(xiàn)出三種類型，一是從愈傷到葉片，帶逐漸消失；二是從愈傷到葉片，帶逐漸出現(xiàn)；三是從愈傷到葉片，帶先出現(xiàn)又消失。這個(gè)結(jié)果意味著在愈傷再生過程中，不同位點(diǎn)DNA甲基化變化規(guī)律不同，DNA甲基化水平可能升高，也

5、可能降低，表現(xiàn)出位點(diǎn)特異性?？傮w上講，DNA甲基化水平在新鮮愈傷中最低，繼代和再生過程都會(huì)上升。部分位點(diǎn)經(jīng)克隆后用作探針進(jìn)行southem blotting雜交，證實(shí)了這些MSAP的帶型。 4.對(duì)部分多態(tài)性帶進(jìn)行克隆和序列分析。19個(gè)多態(tài)性帶克隆測序后，發(fā)現(xiàn)部分帶可能來自多個(gè)位點(diǎn)。對(duì)這些序列進(jìn)行Blast分析后，有18條序列發(fā)現(xiàn)了同源序列，但部分序列同源性很低。這些同源序列一部分與反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子有關(guān)，還有一些與抗逆和代謝有關(guān)。So

6、uthern blotting雜交證實(shí)克隆的序列中有一條拷貝數(shù)很多，即有可能是反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。而克隆的另一條序列與gal-actosyltransferase基因家族相關(guān)。通過一種改良的TAIL-PCR方法，克隆了其下游的一段序列，通過進(jìn)一步分析，表明該片段可能位于一個(gè)galacto-syltransferase基因家族保守結(jié)構(gòu)域內(nèi)，同時(shí)該序列至少存在一條高度同源的序列。 5.通過改良TAIL-PCR，建立了一種更簡單有效的克隆已

7、知序列側(cè)翼序列的方法。將己克隆的DNA序列測序后，利用Blastx搜索同源序列。然后將搜索到的序列進(jìn)行聚類分析，尋找保守的模體。再利用保守模體設(shè)計(jì)簡并引物。利用簡并引物結(jié)合來源于已知序列的特異引物，可快速克隆側(cè)翼序列。這種方法比TAIL-PCR更簡單可靠。 6.為了給柑橘SSR標(biāo)記開發(fā)研究工作提供更多有用信息，對(duì)EMBL擻據(jù)庫中柑橘序列內(nèi)簡單序列重復(fù)(SSR)的豐度進(jìn)行了分析。使用的軟件是MISA?？偣卜治龅?2896條柑橘序列