落葉松體細胞胚胎發(fā)生過程中DNA甲基化分析及MET1、DDM1克隆研究.pdf

1、植物體細胞胚胎發(fā)生是新品種規(guī)模化無性繁殖的主要手段，也是植物細胞全能性研究的理想模式系統(tǒng)，在林木育種、種質保存和遺傳轉化等方面都有重要的科學意義和應用價值。然而，很多植物體細胞胚發(fā)生體系還不完善，存在技術難度大、質量不高、發(fā)生數(shù)量低、畸形胚比例高且難以同步化等問題。體細胞胚胎發(fā)生作為落葉松大規(guī)模無性繁殖的重要途徑，深入研究體細胞胚發(fā)生的表觀遺傳調控機理，揭示其調控模式，可為進一步調控低質量胚胎發(fā)生體系向高效穩(wěn)定胚胎發(fā)生體系轉變提供理論基

2、礎和科學依據(jù)。本研究以雜種落葉松（Larixleptolepis×L. principis-rupprechtii）胚性細胞系Y35為實驗材料，通過MSAP（Methylation-Sensitive Amplified Polymorphism）技術，以落葉松體細胞胚的原胚團時期（0 h）以及ABA誘導的早期單胚（0.5 h、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d）、中期單胚（7 d、14 d）、晚期單胚（21 d）、早期子

3、葉胚（28 d）、中期子葉胚（35 d）、晚期子葉胚（42 d）等7個發(fā)育階段14個發(fā)育時期的體細胞胚為實驗材料，研究其DNA甲基化水平與模式變化，并首次克隆了DNA甲基轉移酶MET1和染色質重塑因子DDM1基因全長cDNA，進行結構預測和分子進化等生物信息學分析。依據(jù)所獲得的實驗數(shù)據(jù)，探討落葉松體細胞胚胎發(fā)生過程中的表觀遺傳調控機制，為落葉松體細胞胚胎發(fā)生機理研究奠定基礎。主要結果如下：
　　1.DNA甲基化研究表明：體細胞胚胎

4、發(fā)生過程中3-42 d時5′-CCGG-3′胞嘧啶總甲基化率負對數(shù)值（y）隨時間（x）變化擬合函數(shù)y=－2E-08x6+3E-06x5－0.0002x4+0.004x3－0.0514x2+0.2885x+0.5398（R2=0.973）。體細胞胚發(fā)育時期與總甲基化率負對數(shù)極顯著，表明在一定程度上可以推測某些發(fā)育時期的總DNA甲基化率。
　　2.總甲基化率在14個時期的中期單胚時期（14 d）最高，晚期子葉胚時期（42 d）最低；全

5、甲基化率（雙鏈5′-CmCGG-3′）的最高在ABA誘導后6 h，而最低在晚期子葉胚的42 d；半甲基化率（單鏈5′-mCCGG-3′）最高時期是ABA誘導2 d，而最低是0.5 h。每兩相鄰時期的DNA甲基化模式變化分析發(fā)現(xiàn)：在5′-CCGG-3′序列的胞嘧啶上，ABA誘導0.5-6 h時，超甲基化最多；而在早期單胚向中期子葉胚轉變的5-7 d時，超甲基化最少。同時，在早期單胚向中期子葉胚轉變的5-7 d，去甲基化最多；而在中期單胚到

6、晚期單胚發(fā)生的14-21 d，去甲基化最少。
　　3.與原胚團時期相比，各時期DNA甲基化模式變化分析發(fā)現(xiàn)：ABA誘導第5 d時， 也即體細胞胚胎發(fā)生至早期單胚時，超甲基化最多；而在第7 d時，即早期單胚開始向中期單胚發(fā)育時，超甲基化最少。同時，ABA誘導第14 d，即體細胞胚胎發(fā)生至中期單胚階段，去甲基化最多；而在第2 d時，去甲基化最少。
　　4.部分差異條帶回收、測序、比對發(fā)現(xiàn)與編碼核糖體蛋白S13（ribo

7、somal protein S13）同源的序列，該片段來自E37+H/M61引物組合對ABA誘導后第14 d中期單胚的MspI酶切連接產物的擴增。
　　5.利用MET1保守域序列兼并引物進行落葉松cDNA擴增，得到403 bp的特異片段，分析得知為落葉松MET1的特異序列，其65-77 aa為酶活性中心。分別通過3' RACE和5' RACE得到1404 bp和3788 bp片段，獲得全長5303 bp。其中，1-77 bp為5'

8、 UTR區(qū)，4872-5303 bp為3' UTR區(qū)，編碼1731個氨基酸，分子量194.67 kDa，命名為LlMET1。通過PFAM和CDD（Conserved Domain Database，NCBI）蛋白結構預測：LlMET1含有兩個BAH結構域，兩個DNMT1-RFD結構域，兩個DNA甲基酶結構域，以及Dcm等多個結構域。系統(tǒng)進化樹研究發(fā)現(xiàn)LlMET1和油棕（Elaeis guineensis）DNA甲基轉移酶MET1的進化關

9、系相近。搜索Y35體細胞胚成熟與原胚團時期的SSH差減文庫，發(fā)現(xiàn)編碼染色質重塑因子相關蛋白DDM1的片段，通過RACE進一步擴增得cDNA全長。系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)落葉松的LlDDM1與小立碗蘚（Physcomitrella patens）的PpDDM1具有較近的進化關系。
　　綜上所述，落葉松體細胞胚胎發(fā)生過程中，存在著頻繁的DNA甲基化水平變化，并在一定時期與體細胞胚發(fā)生時間具有一定關系。同時，也存在頻繁的DNA甲基化模式變化。DN