棗體細胞胚胎發(fā)生及倍性種質創(chuàng)新.pdf

1、本文以冬棗組培苗葉片為外植體，利用固體培養(yǎng)技術，對影響棗葉片體細胞胚胎發(fā)生的多種培養(yǎng)因子進行了研究，并從組織細胞學方面對棗體細胞胚胎形態(tài)建成的機理進行了初步研究；進而利用所建立的葉片體細胞胚胎發(fā)生培養(yǎng)體系進行了多倍體誘導，并利用花藥培養(yǎng)和多細胞起源的不定芽再生體系等多種方法進行了棗的倍性種質創(chuàng)新研究。主要研究結果如下： 1．以冬棗離體葉片為外植體首次建立了冬棗葉片體細胞胚胎發(fā)生培養(yǎng)體系。冬棗離體葉片在MS+麥芽糖20g/L+瓊脂

2、3g/L+TDZ10.0mg/L的固體培養(yǎng)基上，可獲得初始愈傷組織，但愈傷組織在調整滲透壓、激素種類、光照條件及添加防褐化劑的情況下仍不能進行繼代培養(yǎng)。但將葉片接種在MS+麥芽糖20g/L+瓊脂3g/L+TDZ10.0mg/L+AgNO<,3>2.0mg/L的培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)，不經(jīng)過轉換培養(yǎng)基即可一步實現(xiàn)愈傷組織誘導和胚狀體分化，分化率達84.9％。獲得的胚狀體在MS+蔗糖40g/L+瓊脂4g/L+CH500mg/L的無激素培養(yǎng)基上發(fā)育成

3、熟：在1/2MS+蔗糖20g/L+瓊脂4g/L+IBA2.0mg/L的培養(yǎng)基上誘導生根獲得完整再生植株。 2．對冬棗離體葉片體細胞胚胎發(fā)生過程進行組織細胞學觀察發(fā)現(xiàn)：(1)棗葉片體細胞胚以間接方式發(fā)生，即先由葉片脫分化產(chǎn)生愈傷組織，再從愈傷組織上再分化形成胚狀體。(2)棗葉片體細胞胚以單細胞外起源發(fā)生，即葉片體細胞胚胎均起源于胚性愈傷組織中的單個胚性母細胞，且大多數(shù)胚性母細胞位于愈傷組織近表層的幾層細胞。(3)棗體胚發(fā)生過程中存

4、在生理隔離現(xiàn)象。(4)棗葉片體細胞胚發(fā)生存在不同步化現(xiàn)象。(5)棗葉片體細胞胚發(fā)生過程中存在三次淀粉粒積累高峰：胚性愈傷組織時期、球形胚期、魚雷胚期。 3．開展棗花藥培養(yǎng)取得成功。棗花藥在MS+麥芽糖20g/L+2,4-D1.0mg/L的培養(yǎng)基上，可誘導出乳白色、塊狀初始愈傷組織，該類愈傷組織在2,4-D和TDZ作用下均不能進行增殖和分化培養(yǎng)；棗花藥在MS+麥芽糖20g/L+TDZ1.0mg/L的培養(yǎng)基上可誘導出淡黃色、顆粒狀初

5、始愈傷組織，該類愈傷組織在MS+麥芽糖20g/L+TDZ1.0mg/L培養(yǎng)基上繼續(xù)增殖，保持淡黃色顆粒狀，在MS+麥芽糖20g/L+TDZ1.0mg/L+AgNO<,3>0.5mg/L固體培養(yǎng)基上可誘導胚狀體發(fā)生。棗花藥胚狀體易發(fā)生玻璃化現(xiàn)象，在MS+蔗糖40g/L+瓊脂4.0g/L的培養(yǎng)基上，從三倍體贊皇大棗花藥胚狀體中獲得一株正常植株。經(jīng)葉片DNA含量和莖尖染色體數(shù)目鑒定，本試驗首次獲得了贊皇大棗的2n花粉植株。經(jīng)組織細胞學觀察，棗

6、花藥體細胞胚也以間接方式單細胞外起源方式發(fā)生，胚狀體發(fā)生過程中同樣存在生理隔離和不同步化現(xiàn)象，且花藥胚狀體存在畸形胚。 4．利用葉片體細胞胚胎發(fā)生體系一步獲得了冬棗純合四倍體。秋水仙素浸泡法對葉片傷害大，葉片無胚狀體發(fā)生；利用秋水仙素培養(yǎng)基混培法時，棗葉片有胚狀體發(fā)生，當培養(yǎng)基秋水仙素濃度為15mg/L時，再生體胚發(fā)生變異，經(jīng)流式細胞儀葉片DNA含量和莖尖染色體數(shù)目檢測，變異植株為純合四倍體，染色體數(shù)為2n=2x=48。

7、 5．利用葉片直接再生不定芽體系獲得了冬棗二、四倍體嵌合體。棗葉片在MS+瓊脂3g/L+麥芽糖20g/L+BA1.0mg/L或TDZ1.0mg/L+AgN0O<,3>1.0mg/L的培養(yǎng)基上可直接再生不定芽，不定芽再生率分別為97.3％和90.1％。再生不定芽分別在MS+蔗糖40g/L+瓊脂4g/L+BA1.0mg/L+ IBA0.5mg8/L 和 1/2MS+蔗糖 20g/L+瓊脂4g/L+IBA1.0mg/L培養(yǎng)基上增殖和生根。利用

8、秋水仙素培養(yǎng)基混培法在葉片不定芽誘導時進行誘變，當培養(yǎng)基中秋水仙素濃度為15mg/L時，再生不定芽發(fā)生變異，經(jīng)流式細胞儀DNA含量檢測，變異植株為嵌合體。 6．開展了利用田間枝干愈傷組織不定芽再生體系誘導多倍體研究，在TDZ4.0mg/L+AgNO<,3>2.0mg/L作用下，枝干截面形成層處可產(chǎn)生大量乳白色愈傷組織，愈傷組織誘導率高達100％，不定芽誘導率為74.2％。但經(jīng)流式細胞儀DNA含量檢測，秋水仙素處理的田間愈傷組織不