棉花體細胞胚胎發(fā)生能力比較及ipt基因的遺傳轉化.pdf

1、棉花體細胞培養(yǎng)和植株再生技術是進行原生質體培養(yǎng)、遺傳轉化、體細胞雜種創(chuàng)造等技術的必要條件，利用遺傳工程改良棉花品種是目前棉花遺傳改良研究的一個熱門領域，它能有效打破物種間的界限，實現(xiàn)動物、植物和微生物間基因資源的相互利用，并可以實現(xiàn)對目標性狀的定向變異，同時能大大縮短育種年限、加快育種進程。但當前棉花生物技術研究仍然存在著很多障礙，如棉花體細胞胚胎發(fā)生的基因型依賴性強、棉花組織培養(yǎng)周期長、體胚發(fā)生率低、基因遺傳轉化效率低、再生植株結實困

2、難等等，這些問題已經(jīng)成為棉花組織培養(yǎng)、棉花生物技術、棉花功能基因的驗證研究領域的障礙。本研究內容主要涉及棉花體細胞胚胎發(fā)生的調控，不同生態(tài)區(qū)棉花品種體細胞胚胎發(fā)生及再生能力比較；不同基因型海島棉體細胞胚胎發(fā)生能力研究；高效棉花遺傳轉化體系的建立；ipt基因的遺傳轉化及轉基因植株的獲得；同時對轉基因引起的棉花性狀變異的規(guī)律進行初步研究，為轉基因棉花育種提供理論指導。取得的主要研究結果如下： 1．在陸地棉愈傷組織誘導階段，適宜濃度的

3、2,4．D+KT和IBA+KT激素組合均能高效誘導愈傷組織產(chǎn)生，其最優(yōu)激素配比為0.1 mg/L 2,4.D+0.15 mg/L KT和0.5mg/LIBA+0.15 mg/LKT。 2．在陸地棉誘導愈傷組織時，誘導培養(yǎng)基中NH<,4>NO<,3>的水平對愈傷組織以后能否發(fā)生體細胞胚胎分化至關重要，在分化培養(yǎng)基中撤去NH<,4>NO<,3>，并增加KNO<,3>，可以明顯提高愈傷組織胚分化率，使珂字201、YZl的愈傷組織胚分化

4、率達到80％以上。鐵鹽對愈傷組織誘導和胚分化起著十分重要的作用。當愈傷組織誘導培養(yǎng)基中不含鐵鹽時，不同基因型的外植體均未見膨大，更沒有誘導出愈傷組織。硫酸亞鐵的濃度以56 mg/L為佳，此時愈傷組織誘導率達95-100％，將愈傷組織轉入分化培養(yǎng)基上時，添加硫酸亞鐵的濃度為28 mg/L、56 mg/L時，不同基因型的愈傷組織生長都比較迅速，胚分化的時間縮短。 3．利用IBA和KT激素組合，結合不同階段的無機鹽調控，使供試的22個

5、陸地棉品種中有15個品種實現(xiàn)體細胞胚胎分化和植株再生，其中鄂抗棉3號、5號、鄂棉20、23號、豫棉9號、豫早73、豫棉12號、豫棉1221等8個品種是首次獲得體細胞胚胎發(fā)生的品種?？疾煲陨?個品種的系譜發(fā)現(xiàn)，鄂抗棉3、5號主要含有岱字棉15號的血統(tǒng)，鄂棉20含有金字棉的血統(tǒng)，豫棉9、12號則含有福字棉的血統(tǒng)，豫早73含有烏干達棉的血統(tǒng)，其他的材料遺傳背景比較復雜。許多研究表明，珂字棉的再生能力最強，岱字棉較易再生，而含有金字棉、福字棉、

6、烏干達棉血統(tǒng)的品種則較難獲得體細胞胚和再生植株。本試驗中，首次實現(xiàn)了5個含有金字棉、福字棉、烏干達棉血統(tǒng)的品種的體細胞胚胎發(fā)生和植株再生。比較長江和黃河流域棉區(qū)棉花品種的胚胎發(fā)生和植株再生能力發(fā)現(xiàn)，長江流域的10個品種再生6個(分別是鄂抗棉3、5號、鄂抗棉9號、鄂荊1號、鄂棉20、23號)、黃河流域的10個品種再生7個(分別是中棉27號、晉棉18、20號、豫棉9、12號、豫早73和豫棉1221)，表明長江和黃河流域棉區(qū)品種的胚胎發(fā)生和植

7、株再生潛力沒有明顯差別，這與以往研究結果棉花體細胞胚胎發(fā)生有嚴格地域性限制有所不同。但兩大棉區(qū)品種體細胞胚胎發(fā)生和植株再生時間有明顯差異，長江流域棉區(qū)的品種分化時間平均比黃河流域的品種晚近20d。 4．研究發(fā)現(xiàn)海島棉愈傷組織誘導困難、出愈時間長，與相同誘導條件下誘導陸地棉品種相比，出愈時間延遲10-15天，出愈率偏低，主要原因是海島棉外植體易褐化導致生長緩慢，且所有供試海島棉品種剛開始誘導的愈傷組織質地均為硬塊狀且增殖緩慢，由這

8、種硬塊狀愈傷組織進一步誘導、繼代，形成質地疏松的愈傷組織需要一個漫長的過程。最長達236天，這也是海島棉品種難以進行組織培養(yǎng)的主要原因之一。 5．2,4-D的加入對海島棉愈傷組織誘導和胚分化有顯著影響，加入2,4-D不僅能提高出愈率、縮短出愈時間，而且還能使獲得質地疏松愈傷組織的時間大大提前，平均提前達40天以上。在海島棉愈傷組織誘導階段，最佳激素配比為0.2 mg/L 2,4-D+0.4mg/L KT+1.0 mg/L IBA

9、，而在愈傷組織分化階段以0.05 mg/L 2,4-D+0.2 mg/LKT+0.5 mg/L BA為最好。懸浮培養(yǎng)有利于海島棉愈傷組織分化，與相同的固體培養(yǎng)相比，愈傷組織分化率平均提高5％以上，分化時間提前20天以上，但利用懸浮培養(yǎng)未能使在固體培養(yǎng)條件下沒有發(fā)生胚分化的海島棉基因型產(chǎn)生胚分化。 6．對遺傳轉化的影響因子優(yōu)化研究表明，以預培養(yǎng)12天的棉花胚性愈傷組織為轉化受體，用OD<,600>值為0.4．的農(nóng)桿菌菌液侵染，加入

10、50mg/L的乙酰丁香酮(AS)活化，能夠使YZ1、珂字201的抗性愈傷率分別達25.1％和23.8％。 7．利用農(nóng)桿菌介導棉花胚性愈傷組織為轉化受體的遺傳轉化體系，將ipt基因導入到Coker 201、YZ1、Ym4和Em23棉花品種中，獲得的再生植株經(jīng)卡那霉素涂抹、PCR擴增、Southern雜交檢驗，證明ipt基因已整合到部分再生的棉花植株的基因組中。通過對再生植株田間初步觀察發(fā)現(xiàn)，轉基因植株表現(xiàn)出生長旺盛、果枝數(shù)增多、葉

11、功能期延長等特征。 8．研究了不同基因型的遺傳轉化效率并建立了轉基因再生植株的有效成苗技術體系。結果表明：在相同的轉化條件下，不同基因型的轉化效率差異較大，豫早1號和珂字201的遺傳轉化效率及植株再生能力顯著高于豫棉4號和鄂棉23。降低培養(yǎng)基無機鹽濃度，用Phytagel固化，能夠提高胚萌發(fā)成苗率，降低畸形苗頻率，在生根培養(yǎng)中添加少量活性碳提高了根系活力。再生植株長到3～5片真葉時，出現(xiàn)的植株根系發(fā)褐，可以切除，轉移到新鮮的低鹽