擬南芥體細(xì)胞胚胎發(fā)生的機(jī)理研究.pdf

1、植物的各種器官、組織以及懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞和原生質(zhì)體均可誘導(dǎo)形成類似合子胚的結(jié)構(gòu),但它們與合子胚起源不同,稱為胚狀體(Embryoid)。由體細(xì)胞發(fā)生的胚狀體稱為體細(xì)胞胚(Somatic Embryo, SE)。體細(xì)胞胚胎發(fā)生是植物發(fā)育過程中的特殊現(xiàn)象,并在一定程度上重現(xiàn)了合子胚形態(tài)發(fā)生的特性,是植物細(xì)胞潛能完全表達(dá)的一種方式。因此,研究體細(xì)胞胚胎發(fā)生與發(fā)育的機(jī)理對于揭示細(xì)胞全能性與研究合子胚的分化和發(fā)育具有重要意義。本論文著重研究了擬南芥

2、體細(xì)胞胚胎發(fā)生和發(fā)育的分子基礎(chǔ),研究結(jié)果為理解體細(xì)胞胚胎發(fā)生的分子機(jī)理提供了重要信息。主要研究結(jié)果如下： 1.體細(xì)胞胚胎發(fā)生 體細(xì)胞胚的產(chǎn)生首先需要胚性愈傷組織的形成,這個過程是在外源生長素的作用下完成的。除去外源生長素,在愈傷組織表面誘導(dǎo)形成突起狀的體細(xì)胞原胚,然后體細(xì)胞原胚兩側(cè)產(chǎn)生子葉原基,最終形成具有兩片子葉、胚軸和胚根的成熟體細(xì)胞胚。 2.胚特征基因的表達(dá) 通過胚特征基因LEC1,LEC2,FUS

3、3,PEI1和ABI3的表達(dá)模式分析,發(fā)現(xiàn)它們的表達(dá)去除激素的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)階段表達(dá)明顯上調(diào)。利用GUS報告基因?qū)EC2基因的表達(dá)進(jìn)行了分析,結(jié)果顯示它在體細(xì)胞原胚形成的早期開始表達(dá),以后集中在子葉原基和子葉中表達(dá)。說明在體細(xì)胞胚再生過程中,胚特征基因的表達(dá)受到調(diào)節(jié)。 3.WUS和CLV3基因的表達(dá) 為了研究體細(xì)胞胚胎發(fā)生和發(fā)育過程中干細(xì)胞的起始,我們對WUS和CLV3的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。研究結(jié)果顯示,體細(xì)胞胚發(fā)生早期

4、,在胚性愈傷組織表面4～6層細(xì)胞(組織中心)中首先檢測到WUS基因的表達(dá)。然后在新形成的體細(xì)胞原胚表面1～3層細(xì)胞中出現(xiàn)干細(xì)胞特征基因CLV3的表達(dá),并在此位置形成體細(xì)胞原胚的突起狀結(jié)構(gòu)。體細(xì)胞胚發(fā)育過程中,兩基因的表達(dá)均逐漸集中在子葉之間的苗端分生組織中。誘導(dǎo)反義WUS基因表達(dá),體細(xì)胞胚的產(chǎn)生受到抑制,胚發(fā)育基因的表達(dá)也受到影響。表明在體細(xì)胞胚發(fā)生過程中,組織中心的細(xì)胞先于干細(xì)胞形成,WUS此過程中起關(guān)鍵作用。 4.生長素極性

5、運(yùn)輸及分布 體細(xì)胞胚胎發(fā)生需要生長素誘導(dǎo)。生長素在體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中呈極性分布。如果在誘導(dǎo)過程中添加生長素極性運(yùn)輸抑制劑NPA,不僅破壞了生長素的極性分布,還影響了WUS的表達(dá),最終不能產(chǎn)生體細(xì)胞胚。生長素外運(yùn)蛋白PIN1在體細(xì)胞胚發(fā)生過程中呈極性定位。體細(xì)胞胚胎發(fā)生早期,PIN1在即將產(chǎn)生體細(xì)胞原胚的位置表達(dá)。共定位分析顯示,PIN1與WUS的表達(dá)區(qū)域在體細(xì)胞胚胎發(fā)生早期部分重疊,而在發(fā)育后期分離,即PIN1向著即將產(chǎn)生子葉

6、的部分集中,而WUS則集中于子葉之間的苗端分生組織。因此,生長素極性運(yùn)輸及分布亦影響體細(xì)胞胚胎發(fā)生。 5.不同濃度生長素的作用 能夠誘導(dǎo)體細(xì)胞胚產(chǎn)生的生長素濃度具有一定的范圍。如果我們在誘導(dǎo)階段施加過高和過低濃度的生長素,均不能誘導(dǎo)產(chǎn)生體細(xì)胞胚,并且也不能誘導(dǎo)其他器官的產(chǎn)生,只能形成不同形態(tài)的愈傷組織。而在不施加生長素的情況下,只是初級體細(xì)胞胚的繼續(xù)發(fā)育,產(chǎn)生更多的葉和根。進(jìn)一步的研究觀察到在過高或過低濃度的生長素條件下