西瓜愈傷組織誘導(dǎo)及體細(xì)胞胚胎發(fā)生的研究.pdf

1、胚性愈傷組織誘導(dǎo)及體細(xì)胞胚胎發(fā)生對于西瓜的快速繁殖、種質(zhì)資源的保存、優(yōu)良性狀的培育以及基因工程受體系統(tǒng)的優(yōu)化等都具有十分重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。本試驗(yàn)通過培養(yǎng)西瓜無菌苗獲得子葉、子葉節(jié)、下胚軸和胚根外植體，研究了影響愈傷組織和體細(xì)胞胚胎發(fā)生及體胚成熟與萌發(fā)的因素，并對體細(xì)胞胚胎發(fā)生的過程進(jìn)行了細(xì)胞學(xué)觀察。為西瓜高效體胚發(fā)生系統(tǒng)的建立和相關(guān)機(jī)理的研究以及西瓜快速擴(kuò)繁和遺傳轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)。主要試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.篩選了西瓜無菌苗

2、培養(yǎng)的最佳條件:去殼種胚在0.1％ HgCl2溶液中最佳消毒時(shí)間是8 min，超過8 min易導(dǎo)致無菌苗出現(xiàn)藥害現(xiàn)象，低于8 min則外植體接種后易污染。1/2MS培養(yǎng)基是獲得無菌苗的最佳基礎(chǔ)培養(yǎng)基。西瓜為需暗種子，種胚接種后置于連續(xù)黑暗條件下培養(yǎng)3d后再轉(zhuǎn)移到16 h/d光周期條件下，無菌苗生長正常健壯。
　　2.4-5天齡無菌苗是誘導(dǎo)西瓜體胚發(fā)生的最佳苗齡。子葉葉面朝下平置接觸培養(yǎng)基能夠減少卷曲現(xiàn)象，更好的吸收營養(yǎng)物質(zhì)，并產(chǎn)生

3、相對較多的愈傷組織和體胚。1/2子葉外植體比完整子葉更適合西瓜體胚的誘導(dǎo)。接種后外植體最適暗培養(yǎng)時(shí)間是1-2周，不進(jìn)行黑暗處理的外植體誘導(dǎo)率低，長時(shí)間培養(yǎng)后死亡。
　　3.不同基因型的外植體之間體胚誘導(dǎo)率差異顯著，誘導(dǎo)率最高的是抗病京欣，其次是早佳8424，誘導(dǎo)率最低的是黑美人。
　　4.以5天齡無菌幼苗的子葉、子葉節(jié)、下胚軸和胚根為外植體，胚性愈傷組織及體胚誘導(dǎo)率均以胚根最高，其次是子葉和子葉節(jié)，下胚軸幾乎不能誘導(dǎo)體胚發(fā)生

4、。但是胚根外植體上誘導(dǎo)所得體胚，球形胚后期的其他形態(tài)發(fā)生較困難。
　　5.添加單一2，4-D或NAA幾乎不能誘導(dǎo)西瓜外植體體胚發(fā)生，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率也較低。單獨(dú)使用6-BA或TDZ能夠較好的誘導(dǎo)胚性愈傷組織及體胚發(fā)生。其中6-BA濃度達(dá)到4.0 mg/L時(shí)胚根的胚性愈傷組織和體胚誘導(dǎo)率達(dá)到最高，分別為70％和56.7％。單獨(dú)使用TDZ誘導(dǎo)體胚發(fā)生的最適宜濃度為0.1-1.0 mg/L，最佳外植體為胚根，TDZ濃度為0.1 mg/

5、L時(shí)體胚誘導(dǎo)率達(dá)到了55.6％，其次是子葉外植體在TDZ濃度1.0 mg/L時(shí)，為30％。TDZ濃度過高易導(dǎo)致褐化，過低易使外植體產(chǎn)生不定芽。
　　6.細(xì)胞分裂素和生長素組合使用時(shí)，6-BA結(jié)合NAA誘導(dǎo)的愈傷組織質(zhì)地較好，易轉(zhuǎn)變?yōu)榕咝杂鷤M織，其中以MS+6-BA3.0 mg/L+NAA0.1 mg/L誘導(dǎo)體胚發(fā)生效果最佳，誘導(dǎo)率達(dá)到了54.7％。TDZ結(jié)合NAA的培養(yǎng)基中，0.5 mg/L的TDZ和0.05-0.5 mg/L

6、NAA能夠誘導(dǎo)得到生長勢較好的體胚。在6-BA與2，4-D組合的培養(yǎng)基上，體胚誘導(dǎo)率普遍很低，2，4-D濃度超過1.0 mg/L時(shí)誘導(dǎo)得到的基本都是非胚性愈傷組織，超過2.0 mg/L時(shí)不能誘導(dǎo)體胚的發(fā)生。
　　7.體胚成熟與萌發(fā)的促進(jìn):體胚的生長容易在發(fā)育后期停滯或衰退。添加TDZ或GA3后不同程度的促進(jìn)了體胚成熟和萌發(fā)。低濃度無機(jī)鹽也有利于體胚成熟和萌發(fā)，1/2MS培養(yǎng)基上的體胚萌發(fā)率最高，為20％，其次是1/3MS和1/4M