5-甲基胞嘧啶羥化酶TET1在肝再生時卵圓細(xì)胞向肝細(xì)胞分化過程中的作用.pdf

1、肝臟作為人體一個重要代謝器官,當(dāng)其受到不同病因的影響導(dǎo)致的肝細(xì)胞受損后,會發(fā)生不同類型干細(xì)胞介導(dǎo)的肝再生(liver regeneration)。肝干細(xì)胞主要分為內(nèi)源性干細(xì)胞和外源性干細(xì)胞。其中內(nèi)源性干細(xì)胞主要以卵圓細(xì)胞為主;外源性干細(xì)胞主要來源于造血干細(xì)胞,間充質(zhì)干細(xì)胞,內(nèi)皮祖干細(xì)胞等。卵圓細(xì)胞作為肝臟的成體干細(xì)胞在肝臟再生過程中發(fā)揮核心作用。肝卵圓細(xì)胞是存在于肝內(nèi)膽管末端赫令管間隙的一類具有多向分化潛能的細(xì)胞群,其在正常情況下呈靜止

2、狀態(tài),當(dāng)發(fā)生各種肝臟的損傷后便刺激其增殖分化,形成成熟的肝臟細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞,完成肝臟形態(tài)學(xué)和功能學(xué)上的修復(fù)。目前,關(guān)于卵圓細(xì)胞增殖分化的調(diào)控機(jī)制尚無定論。因此,探索其新的調(diào)控機(jī)制很有必要。
　　最新研究報道,表觀遺傳學(xué)的 DNA去甲基化與干細(xì)胞的增殖分化密切相關(guān)。其中 DNA羥化酶 TET1(Ten-eleven translocation1)是催化5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5 mC)去甲基化生成5-羥

3、甲基胞嘧啶(5-hydroymethy1cytosine,5 hmC)的關(guān)鍵因子,其在胚胎干細(xì)胞分化過程中具有促進(jìn)干性基因轉(zhuǎn)錄同時抑制分化基因表達(dá)的雙重作用。即在胚胎干細(xì)胞的發(fā)育過程中呈下調(diào)趨勢。但目前TET1調(diào)節(jié)干細(xì)胞自我更新和分化發(fā)育的具體機(jī)制還在研究之中,尚不明確。
　　因此,本課題分以下幾個部分:1.卵圓細(xì)胞增殖肝再生動物模型的建立,即成功建立卵圓細(xì)胞增殖的動物模型。2.肝卵圓細(xì)胞的分離、提取、培養(yǎng)及鑒定。獲得大鼠原代卵圓

4、細(xì)胞并鑒定其特異性。3.檢測TET1在肝再生動物模型中的動態(tài)變化。通過不同實驗方法檢測TET1在肝再生不同時間段的表達(dá)變化趨勢。4.檢測TET1在卵圓細(xì)胞株 WB-F344向肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化過程中的表達(dá)變化。通過建立誘導(dǎo)卵圓細(xì)胞株WB-F344向肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化的培養(yǎng)體系,觀察TET1在其基因和蛋白水平的表達(dá)變化。通過上述研究,旨在說明:1.TET1在肝再生過程中的明顯的動態(tài)變化。2.TET1在卵圓細(xì)胞分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞過程中明顯下調(diào),

5、從而初步證明TET1可能參與了卵圓細(xì)胞的增殖與肝再生過程。
　　方法
　　1.肝再生動物模型建立取重約150-180g SD大鼠,2-AAF10 mg/kg·d灌胃4d。第5天行2/3肝切除術(shù),之后繼續(xù)2-AAF灌胃。肝切除術(shù)后第3、6、9、12、15天處死大鼠獲取肝臟標(biāo)本。
　　2.原代大鼠卵圓細(xì)胞的提取及鑒定原位肝灌注聯(lián)合離體肝灌注法分離大鼠肝臟細(xì)胞,再采用Percoll密度梯度離心法提取目的卵圓細(xì)胞。鑒定方法包括

6、肝卵圓細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定,細(xì)胞特異性標(biāo)記物鑒定等。
　　3.檢測 TET1在肝再生動物模型中的動態(tài)表達(dá)變化包括 RT-PCR檢測 TET1在mRNA水平的動態(tài)變化,Western blot檢測TET1蛋白水平的表達(dá)趨勢。
　　4.多種細(xì)胞因子聯(lián)合誘導(dǎo)原代大鼠肝卵圓細(xì)胞卵圓細(xì)胞株 WB-F344向肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化根據(jù)實驗分為二組,原代不加任何細(xì)胞因子培養(yǎng)WB-F344為對照組,用SCF20ug/L、HGF10ug/L、EGF10u

7、g/L等細(xì)胞因子誘導(dǎo)7天的WB-F344為實驗組。
　　5.檢測誘導(dǎo)前后 WB-F344細(xì)胞表達(dá)卵圓細(xì)胞和肝細(xì)胞特異性蛋白通過細(xì)胞免疫熒光技術(shù)分別檢測誘導(dǎo)前后卵圓細(xì)胞特異性抗體 OV6,肝細(xì)胞特異性抗體 ALB和AFP,膽管上皮細(xì)胞特異性抗體CK19的蛋白水平表達(dá)變化。
　　6.細(xì)胞免疫熒光、Realtime PCR、Western blot檢測誘導(dǎo)前后TET1 mRNA和蛋白水平表達(dá)變化。
　　結(jié)果
　　1.卵

8、圓細(xì)胞增殖動物模型的成功建立。第3、6、9、12、15天取出大鼠剩余肝臟標(biāo)本,可見隨著時間的推移大鼠腹部切口逐漸愈合,余肝體積增大,直至15天恢復(fù)正常肝臟大小。
　　2.采用原位肝灌注加離體肝灌注法聯(lián)合 Percoll密度梯度離心法獲得的肝卵圓細(xì)胞數(shù)量1.34×105/mL。提取的目的細(xì)胞倒置顯微鏡下可見呈圓球形,培養(yǎng)24h后呈半貼壁狀態(tài)。特異性標(biāo)記物OV6細(xì)胞免疫熒光染色陽性,細(xì)胞純度≥80％。
　　3. RT-PCR、W

9、estern blot檢測TET1在肝再生模型中的基因和蛋白表達(dá)水平。3d組和6d組的TET1基因表達(dá)水平較肝切前對照組明顯升高(P﹤0.01),與其蛋白水平表達(dá)趨勢一致。9d組的表達(dá)量與肝切前表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異性(P﹥0.05)。而肝切后的后期(12、15d) TET1的表達(dá)下調(diào)(P﹤0.05),與其蛋白水平動態(tài)變化趨勢相同。
　　4.卵圓細(xì)胞株WB-F344經(jīng)過SCF20ug/L、HGF10ug/L、EGF10ug/L等細(xì)胞因子

10、誘導(dǎo)后,與誘導(dǎo)前相比較,細(xì)胞呈長梭形細(xì)胞或多角形改變,核質(zhì)比減少,形態(tài)類似于培養(yǎng)狀態(tài)下肝細(xì)胞。
　　5.卵圓細(xì)胞株WB-F344經(jīng)過SCF20ug/L、HGF10ug/L、EGF10ug/L等細(xì)胞因子誘導(dǎo)后,與對照組卵圓細(xì)胞特異性抗體OV6染色陽性,ALB、AFP呈陰性表達(dá)相比,誘導(dǎo)后的細(xì)胞OV6表達(dá)陰性,且肝細(xì)胞特異性標(biāo)記物ALB和AFP呈陽性表達(dá)。
　　6.卵圓細(xì)胞株WB-F344經(jīng)過SCF20ug/L、HGF10ug/

11、L、EGF10ug/L等細(xì)胞因子誘導(dǎo)后,TET1轉(zhuǎn)錄水平明顯下調(diào)(P﹤0.01),細(xì)胞免疫熒光、Western blot檢測誘導(dǎo)前后TET1蛋白水平明顯下降與基因水平表達(dá)一致。
　　結(jié)論
　　1.通過2-AAF聯(lián)合2/3肝切除術(shù)成功建立卵圓細(xì)胞增殖的動物模型。
　　2.在肝再生模型中,通過原代細(xì)胞提取獲得較高數(shù)量和純度的肝卵圓細(xì)胞,證明卵圓細(xì)胞在此過程中大量增殖。
　　3.在肝再生動物模型中TET1的表達(dá)早期明顯