CPED1基因在雞胚胎干細(xì)胞向精原干細(xì)胞分化過程中的作用.pdf

1、分類號(hào)Ⅲ㈣l ＼10 7埸- H 1 大季Y A N G Z H O U U N I V E R S I T Y學(xué)號(hào)M 1 4 8 9 3密 級(jí)碩士學(xué)位論文( 全日制學(xué)術(shù)學(xué)位)C P E D l 基因在雞胚胎干細(xì)胞向精原干細(xì)胞分化過程中的作用王飛指導(dǎo)教師姓名： 奎翌盔塹撞：揚(yáng)劃盤鱟! 姿菱揚(yáng)劌：2 2 三Q Q 窆中請(qǐng)學(xué)位級(jí)別： 亟 ± 學(xué)科專業(yè)名稱：動(dòng)塹逮堡直獨(dú)當(dāng)繁殖論文提交日期： 2 Q ! Z 生魚月論文答辯口期： 2

2、Q 12 生主旦2 2 旦學(xué)位授予單位： 揚(yáng)劌盤堂 學(xué)位授予日期： 2 Q 12 生魚旦2 Q 旦答辯委員會(huì)主席： 塑垂揸塹撞2 0 1 7 年6 月C P E D l 基因在雞胚胎干細(xì)胞向雄性生殖細(xì)胞分化中的作用C P E D l 基因在雞胚胎千細(xì)胞向精原干細(xì)胞分化過程中的作用} 兩要精原干細(xì)胞( s p e n n a t o g o n i a l s t e m c e l l s ，S S C s ) 是動(dòng)物體內(nèi)重要的成體干細(xì)

3、胞，能夠?qū)⑦z傳物質(zhì)傳遞給下一代，它既有胚胎干細(xì)胞的發(fā)育特性又能發(fā)育成單倍體生殖細(xì)胞。現(xiàn)今有大量研究表明精原干細(xì)胞可在體外被誘導(dǎo)為具有不同功能的細(xì)胞系，用于遺傳修飾、疾病治療和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備等，因此對(duì)精原干細(xì)胞體外操作的研究尤為重要。其中將S S C s 誘導(dǎo)形成精子一直是科學(xué)家們研究的熱門話題，但如何大量獲得S S C s 并使其產(chǎn)生具有功能性的精子就成為科學(xué)家們亟需解決的科學(xué)問題。通過本課題組前期已完成的雞雄陛E S C s ，雄陛P

4、 G C s 以及S S C s 的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序( R N A ．S e q ) 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分析得到了雞雄性生殖細(xì)胞發(fā)生過程中基因動(dòng)態(tài)表達(dá)的水平變化，有助于對(duì)該過程中重要作用的未知基因的發(fā)現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)研究的目的基因C P E D l 在S S C s 的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中特異高表達(dá)并功能未知，因此有可能對(duì)S S C s 分化具有重要作用，因此本實(shí)驗(yàn)同時(shí)利用基因過表達(dá)技術(shù)和C R I S P R ／C a s 9技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)測(cè)序過程中發(fā)現(xiàn)的精原干細(xì)

5、胞高表達(dá)基因C P E D l 功能的研究，為闡明生殖細(xì)胞發(fā)生及分化機(jī)制提供高效方法。本研究的主要內(nèi)容如下：( 1 ) 基于本實(shí)驗(yàn)室前期R N A ．S e q 技術(shù)發(fā)現(xiàn)C P E D t 在E S C s 向S S C s 分化過程中存在顯著差異表達(dá)。通過q P C R 克隆如皋黃雞C P E D l 編碼序列，同時(shí)構(gòu)建過表達(dá)載體p c D N A 3 ．0 一C P E D l 和敲除載體C a s 9 ／g R N A 。通過F

6、u g e n e 轉(zhuǎn)染C a s 9 ／g R N A 載體，利用T 7 E 1 酶切、S S A 活性檢測(cè)、T A 克隆測(cè)序和脫靶效率檢測(cè)C a s 9 ／g R N A 載體敲除活性及脫靶情況。在D F ．1 細(xì)胞中通過T 7 E 1 酶切檢測(cè)C a s 9 ／g R N A 載體的活性，酶切結(jié)果表明，通過條帶灰度值估計(jì)C a s 9 ／g R N A l 載體、C a s 9 ／g R N A 2 載體和C a s 9 ／g R