人胚胎干細(xì)胞生物學(xué)性狀及向內(nèi)皮分化過程中ID-1基因作用的研究.pdf

1、人胚胎干(hES)細(xì)胞系可由移植前囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)建立。近年來雖有報(bào)道稱其也可由人卵母細(xì)胞孤雌激活產(chǎn)生的囊胚中分離得到或者由終極分化細(xì)胞通過轉(zhuǎn)基因去分化逆轉(zhuǎn)而成,但由于技術(shù)限制,這些方法均尚未作為建立人胚胎干細(xì)胞系的常規(guī)方法。其基本特征包括自我更新能力、體內(nèi)外的多向分化能力、集落形成、正常的染色體核型、體外適當(dāng)培養(yǎng)條件下的廣泛擴(kuò)增能力及凍融能力。它們的分化潛能為細(xì)胞移植提供了可再生的資源,給患有嚴(yán)重退化性疾病的患者帶來了希望。<

2、br>　　 但人胚胎干細(xì)胞的研究進(jìn)展受到倫理問題和資源匱乏的限制。用于人胚胎干細(xì)胞建系的囊胚由接受不孕癥治療的患者捐獻(xiàn)。選擇用來移植的胚胎通常是由具有雙原核的合子發(fā)育而來的優(yōu)質(zhì)囊胚,而差質(zhì)量或者形態(tài)學(xué)異常受精的囊胚才可能用于科學(xué)研究。有文獻(xiàn)報(bào)道雙倍體的人胚胎干細(xì)胞系可以由單原核來源的合子建系得到,而形態(tài)學(xué)為多原核受精的合子是否也可建立正常的人胚胎干細(xì)胞系,以及形態(tài)學(xué)異常受精的合子來源與正常受精的合子來源的人胚胎干細(xì)胞系在生物學(xué)性狀上有

3、何異同,尚未有明確的報(bào)道。在本文第一部分,我們建立了9株人胚胎干細(xì)胞系,分別來源于正常(雙原核,2PN)和異常原核(未見原核,0PN；單原核,1PN；三原核,3PN)的合子。通過深入比較各株細(xì)胞系的生物學(xué)性狀,發(fā)現(xiàn)正常的人胚胎干細(xì)胞系可以由臨床棄用的具有形態(tài)學(xué)異常原核(0PN,1PN,3PN)的受精合子建立。
　　 人胚胎干細(xì)胞是研究胚胎發(fā)育的良好體外模型。在合適的條件下,人胚胎干細(xì)胞能自發(fā)分化形成包含多種祖細(xì)胞的擬胚體(EB)

4、,其中包括造血系和內(nèi)皮系。就造血系和內(nèi)皮系的發(fā)育而言,EB系統(tǒng)與子宮內(nèi)胚胎的發(fā)育過程相似。TGF-β1作為一種多潛能的細(xì)胞因子在血管發(fā)生和血管生成中起重要的調(diào)節(jié)作用。在體內(nèi)和體外TGF-β1對血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用非常復(fù)雜,它通過其兩種Ⅱ型受體ALK1、ALK5及其下游的Smad家族蛋白對血管生成起雙重調(diào)節(jié)作用,這兩種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)強(qiáng)弱的比值決定了TGF-β1的促進(jìn)或者抑制血管產(chǎn)生的作用。ID蛋白家族是短鏈蛋白(13-20kD)的一個(gè)小家族,其功

5、能是作為堿性螺旋一袢一螺旋(bHLH)轉(zhuǎn)錄因子的主要負(fù)性調(diào)節(jié)因子。據(jù)報(bào)道,Id-1基因可以抑制腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯和終端細(xì)胞分化。最近又發(fā)現(xiàn),Id-1基因是內(nèi)皮細(xì)胞中ALK1的特異性下游基因,它在TGF-β/ALK1-誘導(dǎo)的(Smad依賴的)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中可以介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。但是ID-1基因是否為TGF-β1誘導(dǎo)的人胚胎干細(xì)胞向內(nèi)皮分化及形成血管樣結(jié)構(gòu)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的下游調(diào)控基因,它在該信號傳導(dǎo)通路中有何作用,尚未有確

6、切的研究報(bào)道。在本文第二部分,我們以人胚胎干細(xì)胞(hESC)的體外分化作為血管內(nèi)皮發(fā)育的模型,來研究ID-1基因在TGF-β1誘導(dǎo)的人胚胎干細(xì)胞定向分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞及形成血管樣結(jié)構(gòu)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用,以探討胚胎早期血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。
　　 第一部分由正常和異常原核來源的合子得到的人胚胎干細(xì)胞系生物性狀的比較
　　 目的:人胚胎干細(xì)胞系可建立于正常和異常受精的合子,然而,這兩種類型的人胚胎干細(xì)胞系之間的性狀

7、的異同尚未可知。有文獻(xiàn)報(bào)道雙倍體的人胚胎干細(xì)胞系可以由單原核來源的合子建系得到,但形態(tài)學(xué)為多原核受精的合子是否也可建立正常的人胚胎干細(xì)胞系尚無明確報(bào)道。為了探索這些問題,我們建立了9株人胚胎干細(xì)胞系,分別來源于形態(tài)學(xué)正常(雙原核,2PN)和形態(tài)學(xué)異常(未見原核,0PN；單原核,1PN；三原核,3PN)原核的合子。通過深入比較其性狀異同,以期解決以上問題。
　　 方法:建立來源于形態(tài)學(xué)正常和異常原核的受精合子的hES細(xì)胞系及其培養(yǎng)

8、維持。堿性磷酸酶染色及免疫熒光染色檢測各株細(xì)胞的“干”性,畸胎瘤形成實(shí)驗(yàn)檢測體內(nèi)分化能力,RT-PCR分析檢測體外分化能力。核型分析檢測各株細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性,DNA質(zhì)譜分析檢測每株hES細(xì)胞的基因組DNA的特異性。流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布情況,BrdU摻入實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞系增殖潛力。實(shí)時(shí)定量PCR分析代表分化及未分化基因的表達(dá)水平。hES細(xì)胞的神經(jīng)定向誘導(dǎo)分化檢測神經(jīng)分化潛能。
　　 結(jié)果:我們由46個(gè)臨床廢棄的新鮮囊胚建立了9株

9、人胚胎干細(xì)胞系(細(xì)胞株mSDU-hES1-9),其中5個(gè)為2PN來源,2個(gè)為0PN來源,1個(gè)為1PN來源,1個(gè)為3PN來源。由形態(tài)學(xué)不同原核來源的合子得到的干細(xì)胞系顯示相似的克隆形態(tài),每株細(xì)胞系均能成功凍融,均不存在增殖及自我更新障礙。
　　 結(jié)論:1.來源于形態(tài)學(xué)上不同原核的合子的9株hES細(xì)胞系具有相似的大致特征。所有9株細(xì)胞表達(dá)相似的“干性”標(biāo)記,包括轉(zhuǎn)錄因子及糖脂分子標(biāo)記物:OCT-4,SSEA-3,SSEA-4,TRA

10、-1-60及TRA-1-81；各株細(xì)胞的增殖能力及在擬胚體和畸胎瘤中分化為外胚層、內(nèi)胚層和中胚層細(xì)胞系的潛能也具有相似性。在神經(jīng)定向分化條件下,所有的細(xì)胞株均可分化成神經(jīng)前體和神經(jīng)元。2.在細(xì)胞周期和分化及未分化標(biāo)記基因的相對表達(dá)量等方面存在差異。這些差異在正常來源的不同人胚胎干細(xì)胞系之間也同樣存在。這種現(xiàn)象可能決定于不同細(xì)胞系本身的生物學(xué)特性,而非與形態(tài)學(xué)正?；虍惓Ｔ藖碓聪嚓P(guān)。3.正常的人胚胎干細(xì)胞系可以由臨床棄用的具有形態(tài)學(xué)異常原

11、核的受精合子建立。
　　 第二部分 ID-1基因在TGF-beta1誘導(dǎo)的人胚胎干細(xì)胞定向分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞中的作用探討
　　 目的:分化抑制子/DNA結(jié)合抑制子-1(ID-1)是內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)中活化素受體樣激酶-1(ALK1)的特異性下游基因,它介導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)/ALK1誘導(dǎo)的(Smad依賴的)內(nèi)皮細(xì)胞遷移。然而,ID-1基因在TGF-β1誘導(dǎo)的人胚胎干細(xì)胞向內(nèi)皮分化及血管發(fā)生的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作

12、用,尚未有確切的研究報(bào)道。本文以人胚胎干細(xì)胞(hESCs)的體外分化作為血管內(nèi)皮發(fā)育的模型,來研究ID-1基因在TGF-β1誘導(dǎo)的人胚胎干細(xì)胞定向分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管發(fā)生的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用。
　　 方法:建立TGF-β1誘導(dǎo)的人胚胎干細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞及形成血管樣結(jié)構(gòu)的模型,用免疫熒光定性分析不同濃度的TGF-β1對血管內(nèi)皮定向分化及血管發(fā)生的作用。利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測TGF-β1誘導(dǎo)組及對照組中ID-1基因和

13、內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志基因PECAM、KDR的表達(dá)含量,分析TGF-β1對ID-1基因表達(dá)的影響。利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞分化和血管發(fā)生過程中ID-1基因表達(dá)的時(shí)間動力學(xué)表現(xiàn)。通過小干擾RNA技術(shù)和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析ID-1基因在TGF-β1誘導(dǎo)的人胚胎干細(xì)胞分化的血管內(nèi)皮細(xì)胞中的功能。利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)和western雜交技術(shù)分析分化和血管發(fā)生過程中TGF-β1受體及信號分子蛋白表達(dá)的時(shí)間動力學(xué)表達(dá)。
　　

14、 結(jié)果:我們發(fā)現(xiàn)在hESCs分化為ECs早期,TGF-β1能夠通過抑制ID-1基因的表達(dá)誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞向內(nèi)皮系的定向分化,在分化晚期的血管發(fā)生階段,TGF-β1通過ALK1/Smad1,5/ID-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路增強(qiáng)ID-1基因的表達(dá)而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖。但是TGF-β1在血管生成過程中對于血管出芽卻起抑制作用。另外,TGF-β1誘導(dǎo)的人胚胎干細(xì)胞定向分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞過程及ID-1基因的表達(dá)對于TGF-β1不僅具有時(shí)間依賴性,而且具有

15、濃度的依賴性。通過沉默ID-1基因來降調(diào)該基因的表達(dá)將促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)的人胚胎干細(xì)胞定向分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞而抑制分化的內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移。
　　 結(jié)論:運(yùn)用TGF-β1誘導(dǎo)的人胚胎干細(xì)胞分化模型,我們分析了在向內(nèi)皮系分化及分化的內(nèi)皮細(xì)胞增殖過程中ID-1基因的功能。我們的數(shù)據(jù)表明,在分化過程中TGF-β1可以通過ALK5通路刺激內(nèi)皮方向的分化,而在增殖過程中則通過TGF-β1/ALK1/ID-1,Smad1/Smad5依賴的