跨膜蛋白66在血管再狹窄中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的:
　　冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(Coronary atherosclerotic heart disease，CHD)嚴(yán)重危害人類健康，經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動(dòng)脈介入治療(Percutaneous Coronary Intervention，PCI)是治療冠心病的重要手段，過去20多年來，PCI治療雖然取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，但支架內(nèi)再狹窄(Restenosis，RS)的發(fā)生率仍高達(dá)10％，嚴(yán)重影響了PCI的臨床療效。因此，探討RS的發(fā)

2、生機(jī)制是指導(dǎo)其防治的關(guān)鍵。血管內(nèi)皮損傷后的內(nèi)膜增生是血管再狹窄的重要病理過程，血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cells，VSMCs)的增殖和遷移是內(nèi)膜增生的主要原因。研究表明鈣庫操縱性鈣內(nèi)流(store operated calcium entry,SOCE)在VSMCs增殖、遷移和血管內(nèi)膜增生的過程中發(fā)揮著重要作用，跨膜蛋白66(transmembrane protein66，TMEM66)是新近發(fā)現(xiàn)的

3、鈣庫操控性鈣通道(store-operated calcium channel，SOC)的重要組成部分，可以調(diào)控SOCE。我們推測(cè)TMEM66可能也是通過調(diào)控血管內(nèi)皮損傷后VSMCs增殖、遷移，抑制血管內(nèi)皮損傷后內(nèi)膜的過度增生，從而減輕血管再狹窄。
　　為了驗(yàn)證以上推測(cè)，本實(shí)驗(yàn)分為兩部分進(jìn)行。第一部分通過高脂飲食聯(lián)合球囊損傷建立SD、ApoE基因敲除(ApoE-/-)兩種大鼠血管損傷再狹窄模型，分析兩種大鼠模型的差異。第二部分通過

4、球囊損傷復(fù)制SD大鼠頸動(dòng)脈血管再狹窄模型，觀測(cè)血管中TMEM66的表達(dá)變化情況。通過慢病毒特異性轉(zhuǎn)染過表達(dá)TMEM66，觀測(cè)各組血管再狹窄變化情況，以明確TMEM66在血管損傷再狹窄中的作用。通過檢測(cè)不同干預(yù)組VSMCs增殖、遷移，探討TMEM66在血管損傷再狹窄中的作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.分為SD大鼠假手術(shù)組、SD大鼠手術(shù)組、ApoE-/-大鼠假手術(shù)組、ApoE-/-大鼠手術(shù)組。兩種大鼠高脂飲食喂養(yǎng)2周后檢測(cè)血常規(guī)

5、，甘油三酯(TG)、空腹血糖(Glu)，血清總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)水平。兩種大鼠手術(shù)組均行左側(cè)頸總動(dòng)脈球囊損傷術(shù)，假手術(shù)組不行球囊損傷，其余過程同手術(shù)組，術(shù)后繼續(xù)高脂飲食喂養(yǎng)2周取材。H&E染色觀測(cè)斑塊大小，油紅O染色、MASSON染色、免疫熒光染色檢測(cè)斑塊成分。
　　2.SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)

6、照組（行假手術(shù)）、手術(shù)組（行左側(cè)頸總動(dòng)脈球囊損傷）、空載病毒組（左側(cè)頸總動(dòng)脈球囊損傷后行空載病毒轉(zhuǎn)染）、TMEM66過表達(dá)組（左側(cè)頸總動(dòng)脈球囊損傷后行TMEM66基因過表達(dá)轉(zhuǎn)染）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)假手術(shù)組和手術(shù)組血管TMEM66表達(dá)情況。免疫組化染色觀察TMEM66表達(dá)情況。H&E染色觀測(cè)各組血管再狹窄情況。
　　3.VSMCs隨機(jī)分為對(duì)照組、PDGF處理組（PDGF處理）、空載病毒組（空載病毒轉(zhuǎn)染

7、后，予以PDGF處理）、TMEM66過表達(dá)組(TMEM66基因過表達(dá)轉(zhuǎn)染后，予以PDGF處理)，EdU染色檢測(cè)VSMCs增殖能力，劃痕試驗(yàn)檢測(cè)VSMCs遷移能力。
　　結(jié)果:
　　1.ApoE-/-大鼠組血膽固醇及炎癥介質(zhì)明顯高于SD大鼠組;兩種大鼠手術(shù)組均有明顯再狹窄斑塊形成;ApoE-/-大鼠血管再狹窄斑塊成分以脂質(zhì)浸潤(rùn)、纖維沉積為特點(diǎn)，細(xì)胞成分以巨噬細(xì)胞及VSMCs為主，SD大鼠血管再狹窄斑塊成分則以VSMCs為主。<