跨膜蛋白CD36跨膜區(qū)相互作用的分子機制研究.pdf

1、跨膜蛋白CD36是一類位于多種類型細胞表面上的B型清道夫受體，它在先天免疫，血栓形成，細胞粘附，以及脂質(zhì)轉(zhuǎn)運等方面均有至關(guān)重要的作用。為了比較全面的了解CD36介導(dǎo)的配體結(jié)合和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，我們對CD36的結(jié)構(gòu)及其跨膜區(qū)相互作用的分子機制進行研究。
　　CD36具有兩個跨膜結(jié)構(gòu)域，我們之前的實驗結(jié)果表明它的第二個跨膜區(qū)沒有明顯的二聚作用。通過查詢NCBI數(shù)據(jù)庫我們發(fā)現(xiàn)CD36的第一個跨膜區(qū)(TM1)包含許多保守的甘氨酸殘基。這些甘

2、氨酸可能會以GxxxG基序的形式參與影響同源二聚作用。因此，本論文中主要研究CD36的第一個跨膜區(qū)。TOXCAT是一種用于定量檢測細菌E.coli真實的內(nèi)膜上跨膜螺旋自聚的方法。首先利用這種方法進行CD36跨膜區(qū)相互作用的研究，實驗中以二聚作用最強的血型糖蛋白A(GpA)的CAT活性作為100％，檢測得出CD36野生型(WT)的CAT活性為87.5％，說明其存在比較強的同源二聚作用。將殘基G12，G16和A20突變成異亮氨酸(Ⅰ)，顯著

3、降低二聚作用?？傮w實驗結(jié)果表明，G12xxxG16xxxA20基序?qū)D36跨膜域的二聚作用至關(guān)重要。
　　利用計算機進行跨膜多肽相互作用的模擬，突變G16I聚合時只出現(xiàn)右手-35°構(gòu)象，N端距離為18埃左右，而G23I聚合時只出現(xiàn)右手-20°構(gòu)象，N端距離為10埃左右。為了研究它們相互作用時的構(gòu)象，通過Fmoc固相合成法分別合成N端連有一個色氨酸(W)與一個半胱氨酸(C)的四個多肽G16I-W，G16I-C，G23I-W，G23

4、I-C。選取特異性與巰基反應(yīng)的熒光基團mBBr
　　（單溴二胺）標(biāo)記G16I-C和G23I-C，采用色氨酸誘導(dǎo)的熒光淬滅方法對跨膜多肽相互作用的構(gòu)象進行研究。F0與FW分別代表色氨酸不存在與存在的情況下的整體熒光強度，熒光強度數(shù)據(jù)(F0/FW)取決于mBBr到色氨酸的Cα-Cα距離，即反映出兩條多肽鏈相互作用時的構(gòu)象。結(jié)果顯示G16I跨膜多肽相互作用時Cα-Cα距離大于15埃，G23I相互作用時Cα-Cα距離為11埃，這與計算機模