蛋白激酶C在腫瘤再增殖中的作用及作用機(jī)制研究.pdf

1、腫瘤細(xì)胞再增殖被認(rèn)為是腫瘤在放療或化療后發(fā)生復(fù)發(fā)的一個(gè)主要原因。為了搞清楚這一問(wèn)題，本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)在經(jīng)放療或化療處理后，瀕死的腫瘤細(xì)胞會(huì)釋放強(qiáng)烈的促進(jìn)生長(zhǎng)的信號(hào)來(lái)刺激周?chē)钅[瘤細(xì)胞的增殖。凋亡過(guò)程中重要的執(zhí)行分子caspase3與此刺激作用有關(guān)。被激活的caspase3能夠激活不依賴(lài)鈣離子的磷脂酶A2(iPLA2)，激活的iPLA2則進(jìn)一步促進(jìn)花生四烯酸的釋放和前列腺素E2(PGE2)的產(chǎn)生。產(chǎn)生的PGE2是強(qiáng)烈的有絲分裂原，

2、大量研究報(bào)道PGE2可最終刺激周?chē)钅[瘤細(xì)胞的增殖。然而，除了iPLA2以外，我們推測(cè)caspase3還可能激活其它蛋白分子而在腫瘤再增殖過(guò)程中發(fā)揮作用，比如蛋白激酶C(PKC)。PKC是一個(gè)至少包含11個(gè)亞型的大家族，不同的亞型具有不同的功能和作用。其中的某些亞型，比如PKCδ可被caspase3切割并激活，且PKCδ具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。因此，本課題旨在研究PKC在胰腺癌和結(jié)腸癌腫瘤再增殖過(guò)程中所起的作用以及分子機(jī)制。
　　

3、放射治療后大量的腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，殘存的少量腫瘤細(xì)胞可快速增殖，是腫瘤復(fù)發(fā)的主要原因之一。我們?cè)隗w外建立并優(yōu)化了胰腺癌和結(jié)腸癌的腫瘤再增殖模型。在這個(gè)模型中，我們將大量經(jīng)過(guò)X射線照射的腫瘤細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞(Feeder)，少量的熒光素酶標(biāo)記的活腫瘤細(xì)胞作為報(bào)告細(xì)胞(Reporter)，鋪到大量瀕死未標(biāo)記腫瘤Feeder細(xì)胞上，并通過(guò)觀察活腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)情況來(lái)判斷腫瘤細(xì)胞發(fā)生再增殖的情況。我們發(fā)現(xiàn)，胰腺癌細(xì)胞Panc1和結(jié)腸癌細(xì)胞HT29

4、在經(jīng)過(guò)X射線照射處理后，凋亡細(xì)胞的比例明顯增加，凋亡的Panc1和HT29細(xì)胞能顯著刺激活腫瘤細(xì)胞的增殖。更重要的是，我們發(fā)現(xiàn)caspase3，caspase7和PKCδ在瀕死胰腺癌和結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞刺激活腫瘤細(xì)胞增殖這個(gè)過(guò)程中都起極其重要地作用。經(jīng)過(guò)X射線照射處理后Panc1細(xì)胞和HT29細(xì)胞中被切割的caspase3， caspase7和PKCδ均顯著增加。為了證實(shí)caspase3，caspase7和PKCδ在此過(guò)程中的重要性，我們構(gòu)

5、建了穩(wěn)定表達(dá)caspase3，caspase7和PKCδ的顯性負(fù)性突變體的腫瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)突變體的腫瘤細(xì)胞在X射線照射處理后，其對(duì)活腫瘤細(xì)胞增殖的刺激能力都被顯著減弱。我們還采用了PKC全酶抑制劑GF109203x以及PKCδ特異性抑制劑Rottlerin來(lái)進(jìn)一步證實(shí)了PKCδ在此過(guò)程中的重要性。另外，我們發(fā)現(xiàn)在過(guò)表達(dá)caspase3或caspase7突變體的Pane1細(xì)胞中， PKCδ的切割和激活被顯著減弱，提示PKCδ參與瀕死腫

6、瘤細(xì)胞刺激活腫瘤細(xì)胞再增殖的過(guò)程是受到caspase3和caspase7的調(diào)控。
　　為了進(jìn)一步揭示PKCδ作用的途徑，我們利用Western Blot檢測(cè)了一系列信號(hào)傳導(dǎo)分子的表達(dá)水平和磷酸化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)X射線照射處理后的Panc1和HT29細(xì)胞中Akt，p38絲裂原激活蛋白激酶(p38 MAPK)以及c-Jun氨基末端激酶/應(yīng)激激活蛋白激酶（JNK/SAPK或JNK1/2）磷酸化水平均顯著性增加，因此被激活。抑制PKCδ的活

7、性后，我們發(fā)現(xiàn)Panc1細(xì)胞中Akt和p38 MAPK的磷酸化激活被顯著性抑制，但HT29細(xì)胞中只有Akt的磷酸化激活被顯著性抑制。這提示PKCδ在這兩株腫瘤細(xì)胞中所調(diào)控的下游因子存在差異，其中Akt可能起更重要的作用。
　　在HT29細(xì)胞中，我們進(jìn)一步利用PI3K/Akt通路抑制劑LY294002預(yù)處理HT29細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)抑制Akt活性能顯著性抑制凋亡的HT29細(xì)胞刺激活腫瘤細(xì)胞再增殖的能力。這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了Akt在此瀕死細(xì)胞

8、刺激活腫瘤細(xì)胞增殖過(guò)程中的重要性，并明確了caspase3/7-PKCδ-Akt信號(hào)通路在結(jié)腸癌細(xì)胞HT29的腫瘤再增殖過(guò)程中起重要作用。
　　為了尋找Akt下游的生長(zhǎng)因子，我們檢測(cè)了經(jīng)過(guò)X射線照射處理后Panc1細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在X射線照射處理后VEGF表達(dá)水平顯著升高，并且當(dāng)用PI3K/Akt通路抑制劑LY294002預(yù)處理后，能顯著地抑制VEGF的表達(dá)上調(diào)。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)VEGF的受體之一Fl