蛋白激酶C-α在吸煙及低氧誘導肺血管重建中作用的研究.pdf

1、目的：長期吸煙不僅可引起呼吸性細支氣管炎，慢性阻塞性肺氣腫，還可以導致肺血管結(jié)構(gòu)的重建，這種肺血管結(jié)構(gòu)重建的發(fā)生早于肺氣腫的形成，但其發(fā)生的機制尚不明確，而成為國內(nèi)外研究的熱點之一。慢性肺動脈高壓(pulmonaryhypertension，PH)是許多呼吸系統(tǒng)疾病的常見病理生理過程，臨床上缺少有效的治療方法。肺動脈高壓的形成機制較為復雜，涉及多種因素的相互作用。目前認為肺動脈平滑肌細胞(pulmonaryarterysmoothmus

2、clecell，PASMC)的增殖和低氧性肺血管的重建以及低氧性肺血管的收縮是慢性低氧性肺動脈高壓的形成的病理生理基礎(chǔ)。其中低氧性肺血管重建在慢性低氧性肺動脈高壓的發(fā)病機制中具有十分重要的作用，而PASMC增殖和凋亡的平衡失調(diào)是肺血管重建的關(guān)鍵。因此，探討PASMC的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導途徑對PASMC增殖和凋亡的平衡和肺血管重建的影響，為明確吸煙誘導肺血管重建及慢性肺動脈高壓的發(fā)病機制，尋找更有針對性的有效治療方法，具有重要意義。

3、作為細胞內(nèi)生物信號轉(zhuǎn)導途徑中的關(guān)鍵酶，蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)是細胞外信號與細胞核反應(yīng)間信號轉(zhuǎn)導的共同通路，在介導細胞的增生、凋亡和平滑肌細胞的收縮等信號中起重要作用。我們實驗室以前的研究已表明PKC生物信號轉(zhuǎn)導通道參與了缺氧性肺動脈高壓發(fā)病的兩個關(guān)鍵環(huán)節(jié)——缺氧性腫血管收縮和缺氧性肺血管重建。另有研究發(fā)現(xiàn)PKC-α可通過促進肺動脈平滑肌細胞的增殖等作用而參與低氧性肺動脈高壓的形成。國外研究提示香煙煙霧提取物(

4、cigarettesmokeextract，CSE)可使肺動脈內(nèi)皮細胞、上皮細胞等多種細胞中的PKC活化。但目前國內(nèi)外尚少見對PKC生物信號轉(zhuǎn)導通道在吸煙誘導肺血管重建機制中作用的研究。 本研究擬通過在體動物實驗和人體肺組織標本實驗，探討PKC在吸煙及低氧誘導腫血管重建中的作用，為進一步明確肺動脈高壓、吸煙誘導肺血管重建的發(fā)病機制提供理論依據(jù)。 方法：本研究通過復制大鼠慢性吸煙、低氧、吸煙+低氧動物模型。右心導管法測定并

5、記錄肺動脈平均壓(meanpulmonaryarterypressure，mPAP)；取心臟分離右心室、左心室及室間隔，計算右心室肥厚指數(shù)(rightventricularhypertrophyindex，RVHI)；彈力纖維染色計算腺泡內(nèi)肺動脈三種類型血管的構(gòu)成比，免疫組織化學平滑肌肌動蛋白(alpha-smoothmuscle-actin，α-SM-actin)染色以顯示肺血管重建；采用原位末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶標記法(insitu

6、endlabelingtechnique，TUNEL)檢測PASMC凋亡，免疫組織化學增殖細胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen，PCNA)染色方法檢測PASMC增殖；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR)技術(shù)檢測肺小動脈PKC-αmRNA的表達；免疫熒光技術(shù)及Westernblot技術(shù)檢測肺小動脈PKC-α蛋白表達

7、。 另外，在每天被動吸煙前30分鐘，我們還對一組大鼠腹腔注射葛根素(100mg·kg體重-1)，觀察葛根素對吸煙誘導肺血管重建的治療作用及其對肺小動脈中PKC-αmRNA及蛋白表達的影響，以探討其作用機制及其應(yīng)用價值，為尋找更為有效的治療藥物提供實驗依據(jù)。 結(jié)果：1.與正常對照組相比，H4w組、H8w組、SH4w組、SH8w組大鼠mPAP均明顯增高(P＜0.001)，而S4w組和S8w組則無明顯升高(P＞0.05)。吸煙

8、組、低氧組和低氧+吸煙組各組大鼠RVHI、肌型動脈占血管總數(shù)的百分值(CMA/IAPA)及α-SM-actin表達量均明顯高于C組(P＜0.001)。PASMC凋亡增加，增殖明顯增加，凋亡指數(shù)和增殖指數(shù)均高于正常對照組大鼠(P＜0.01)。肺動脈PKC-αmRNA和蛋白質(zhì)的表達均增強(P＜0.01)。隨著實驗時間的延長，這種差異更明顯。S8w組與S4w組比較、H8w組與H4w組比較、SH8w組與SH4w組比較，差異均有極顯著性意義(P＜

9、0.001)。 2.吸煙非COPD和吸煙COPD患者肺血管重構(gòu)明顯，兩組患者肺動脈平滑肌細胞的增殖指數(shù)和α-SM-actin表達量均明顯高于非吸煙非COPD(均P＜0.001)。吸煙COPD患者肺血管重構(gòu)更明顯，肺動脈平滑肌細胞的增殖指數(shù)和α-SM-actin表達量均高于吸煙非COPD(P＜0.001，P＜0.05)。吸煙非COPD患者肺小動脈PKC-α在轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個水平的表達均明顯高于非吸煙非COPD患者(P＜0.001)；

10、吸煙COPD患者動脈血氧分壓PaO2明顯低于吸煙非COPD患者(P＜0.05)，肺小動脈PKC-αmRNA及蛋白質(zhì)表達水平均明顯高于吸煙非COPD患者(P＜0.01)。 3.與正常對照組相比，吸煙組和丙二醇溶劑對照組大鼠肌型動脈占血管總數(shù)的百分值及α-SM-actin表達量明顯增加(P＜0.01，P＜0.05)；PASMC凋亡增加，增殖明顯增加，凋亡指數(shù)和增殖指數(shù)均高于正常對照組大鼠(P＜0.01)；肺動脈PKC-αmRNA和蛋

11、白質(zhì)的表達增強(P＜0.01)。與吸煙組和丙二醇溶劑對照組相比，葛根素用藥組大鼠肌型動脈數(shù)目和α-SM-actin表達量減少；PASMC凋亡增加，增殖減少；PKC-αmRNA和蛋白質(zhì)表達量均降低(P＜0.01)。丙二醇溶劑對照組和吸煙組相比各項指標差異均無顯著性意義(P＞0.05)。 結(jié)論：1.吸煙和低氧均能誘導PASMC凋亡與增殖，但PASMC增殖過度、凋亡不足，即凋亡與增殖的平衡失調(diào)，而導致肺血管重建，二者協(xié)同作用可加重肺血

12、管重建。 2.吸煙和低氧均能誘導肺小動脈PKC-αmRNA及蛋白質(zhì)表達，且二者具有協(xié)同作用。PKC-α可能參與慢性吸煙大鼠PASMC的增殖過程。 3.長期吸煙非COPD和COPD患者肺組織存在肺血管重建，其可能機制既有香煙的直接作用，又有長期吸煙誘導COPD的低氧因素，通過激活細胞內(nèi)PKC生物信號傳導通道而引起。 4.葛根素能減輕吸煙誘導的血管重建，其可能機制是葛根素通過抑制PKC-α的表達從而阻斷PKC信號轉(zhuǎn)導