內(nèi)皮源性NO介導(dǎo)的低氧信號啟動星形膠質(zhì)細(xì)胞低氧代償?shù)臋C(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　大腦對缺氧最為敏感，缺氧可導(dǎo)致腦水腫和神經(jīng)細(xì)胞受損，嚴(yán)重影響大腦功能。對于不同程度的乏氧性缺氧(hypoxic hypoxia)，大腦將表現(xiàn)出不同程度的神經(jīng)功能紊亂，如急性重度缺氧將引起頭痛、煩躁、驚厥、昏迷甚至死亡;慢性中度缺氧將引起疲勞、嗜睡、注意力不集中、記憶力下降等癥狀;而輕度及早期乏氧性缺氧發(fā)生時由于腦血管及星形膠質(zhì)細(xì)胞系統(tǒng)的代償性低氧保護(hù)反應(yīng)，可為神經(jīng)元提供充分的氧供和能量底物，以維持大腦的正常生理功能，因

2、此，研究輕度缺氧條件下中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)代償性低氧保護(hù)機(jī)制，對于乏氧性缺氧腦損傷疾病的預(yù)防和治療具有重要意義。
　　本研究擬分離培養(yǎng)大鼠原代腦星形膠質(zhì)細(xì)胞和原代BMEC，探索腦星形膠質(zhì)細(xì)胞未感受缺氧的氧氣閾值濃度，并在此缺氧條件下研究外源性給藥產(chǎn)生和共培養(yǎng)BMEC源性釋放的NO預(yù)處理能否阻斷腦星形膠質(zhì)細(xì)胞HIF-1α蛋白的降解，以及對葡萄糖代謝與無氧糖酵解、葡萄糖和乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)、血管新

3、生等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)調(diào)控;同時對照清除NO或抑制NO生成，并結(jié)合運(yùn)用RNAi技術(shù)干擾HIF-1α基因轉(zhuǎn)錄，探索NO-低氧信號如何介導(dǎo)腦星形膠質(zhì)細(xì)胞的低氧保護(hù)反應(yīng)，以期初步闡明BMEC源性NO介導(dǎo)的低氧信號傳導(dǎo)啟動腦星形膠質(zhì)細(xì)胞低氧保護(hù)反應(yīng)的作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究乏氧性缺氧腦損傷疾病的致病機(jī)制與干預(yù)保護(hù)措施奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　第一部分 大鼠腦星形膠質(zhì)細(xì)胞、腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)與鑒定
　　1.分離培養(yǎng)

4、原代腦星形膠質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞鑒定:采用一步酶消化及振蕩純化的方法分離培養(yǎng)大鼠大腦星形膠質(zhì)細(xì)胞;免疫熒光染色法檢測GFAP的表達(dá)用于腦星形膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定;
　　2.分離培養(yǎng)原代腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞鑒定:采用兩步酶消化、梯度密度離心及嘌呤霉素純化的方法分離培養(yǎng)大鼠大腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞;免疫熒光染色法檢測vWF相關(guān)抗原的表達(dá)用于腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定。
　　第二部分 外源性NO啟動輕度缺氧星形膠質(zhì)細(xì)胞低氧保護(hù)反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究
　　

5、1.不同氧氣濃度條件對原代腦星形膠質(zhì)細(xì)胞HIF-1α蛋白水平的影響:Western blot檢測21％、9％、7％、5％、3％和1％氧氣濃度條件下星形膠質(zhì)細(xì)胞HIF-1α蛋白水平，以獲得星形膠質(zhì)細(xì)胞未感受缺氧的氧氣閾值濃度;
　　2.5％ O2輕度缺氧條件下，DETA（NO供體）對原代腦星形膠質(zhì)細(xì)胞HIF-1α蛋白水平的影響:Western blot檢測DETA不同劑量處理和不同處理時間后腦星形膠質(zhì)細(xì)胞HIF-1α蛋白水平;

6、>　　3.5％ O2輕度缺氧條件下，DETA對原代腦星形膠質(zhì)細(xì)胞葡萄糖代謝相關(guān)酶基因、葡萄糖和乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白基因、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)基因轉(zhuǎn)錄水平， VEGF蛋白表達(dá)水平和乳酸(LAC)釋放水平的影響:RT-qPCR檢測DETA處理后腦星形膠質(zhì)細(xì)胞PDK1、LDHA、LDHB、HK1、HK2、GLUT1、GLUT3、MCT1、MCT2、MCT4、VEGF基因轉(zhuǎn)錄水平;Western blot檢測DETA處理后腦星形膠質(zhì)細(xì)胞VEG

7、F蛋白水平，酶促動力學(xué)比色法檢測培養(yǎng)液LAC釋放水平;
　　4.干擾原代腦星形膠質(zhì)細(xì)胞HIF-1α基因轉(zhuǎn)錄后，DETA對5％ O2輕度缺氧條件下腦星形膠質(zhì)細(xì)胞葡萄糖代謝相關(guān)酶基因、葡萄糖和乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白基因、VEGF基因轉(zhuǎn)錄水平，VEGF蛋白表達(dá)水平和LAC釋放水平的影響:采用HIF-1α特異性siRNA干擾原代腦星形膠質(zhì)細(xì)胞HIF-1α基因轉(zhuǎn)錄，RT-qPCR和Western blot鑒定細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率;RT-qPCR檢測DETA

8、處理后腦星形膠質(zhì)細(xì)胞PDK1、LDHA、HK1、HK2、GLUT1、MCT4、VEGF基因轉(zhuǎn)錄水平;Western blot檢測DETA處理后星形膠質(zhì)細(xì)胞VEGF蛋白水平，酶促動力學(xué)比色法檢測培養(yǎng)液LAC釋放水平。
　　第三部分 腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞源性NO啟動輕度缺氧星形膠質(zhì)細(xì)胞低氧保護(hù)反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究
　　1.5％ O2輕度缺氧條件下，原代腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和原代腦星形膠質(zhì)細(xì)胞NO的釋放水平:熒光分析法分別檢測腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和

9、腦星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中Nitrite/Nitrate水平;
　　2.5％ O2輕度缺氧條件下，腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞源性NO對原代腦星形膠質(zhì)細(xì)胞HIF-1α蛋白水平的影響:采用Transwell培養(yǎng)板進(jìn)行原代腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞與原代腦星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，Western blot檢測共培養(yǎng)后腦星形膠質(zhì)細(xì)胞HIF-1α蛋白水平;
　　3.5％ O2輕度缺氧條件下，腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞源性NO對原代腦星形膠質(zhì)細(xì)胞葡萄糖代謝相關(guān)酶基因、葡萄糖和

10、乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白基因、VEGF基因轉(zhuǎn)錄水平，VEGF蛋白表達(dá)水平和LAC釋放水平的影響:采用Transwell培養(yǎng)板進(jìn)行原代腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞與原代腦星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng);RT-qPCR檢測腦星形膠質(zhì)細(xì)胞PDK1、LDHA、HK1、HK2、GLUT1、MCT4、VEGF基因轉(zhuǎn)錄水平;Western blot檢測原代腦星形膠質(zhì)細(xì)胞VEGF蛋白水平;酶促動力學(xué)比色法檢測培養(yǎng)液LAC釋放水平。
　　結(jié)果:
　　第一部分:
　　1.

11、獲得原代培養(yǎng)的大鼠大腦星形膠質(zhì)細(xì)胞，純度為98.4％;
　　2.獲得原代培養(yǎng)的大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，純度為95.2％。
　　第二部分:
　　1.與常氧條件(21％ O2)相比，1～3％氧氣濃度條件下，原代腦星形膠質(zhì)細(xì)胞HIF-1α蛋白水平顯著升高，而5～9％氧氣濃度條件下，HIF-1α蛋白水平無顯著性變化，提示5％ O2氧氣濃度條件是原代腦星形膠質(zhì)細(xì)胞未感受缺氧的臨界濃度，我們將此低氧條件定義本實(shí)驗(yàn)研究的輕度缺氧條件;

12、
　　2.5％ O2輕度缺氧條件下，1.0 mM DETA（NO供體）預(yù)處理12h能夠誘導(dǎo)原代腦星形膠質(zhì)細(xì)胞HIF-1α蛋白水平上調(diào)，但能被NO清除劑抑制;
　　3.5％ O2輕度缺氧條件下，DETA預(yù)處理后原代腦星形膠質(zhì)細(xì)胞PDK1、LDHA、HK1、HK2、GLUT1、GLUT3、MCT4、VEGF基因轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，VEGF蛋白水平和LAC釋放水平顯著升高;
　　4.5％ O2輕度缺氧條件下，干擾原代腦星形膠質(zhì)

13、細(xì)胞HIF-1α基因轉(zhuǎn)錄能夠抑制DETA上調(diào)PDK1、LDHA、HK1、HK2、GLUT1、GLUT3、MCT4、VEGF基因轉(zhuǎn)錄，抑制VEGF蛋白表達(dá)和LAC釋放。
　　第三部分:
　　1.5％ O2輕度缺氧條件下，原代腦星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生和釋放的NO較少(86±41 nMNitrite/Nitrate)，而原代腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞能夠釋放一定量的NO(832±83 nMNitrite/Nitrate，與0.8 mM DETA釋

14、放的Nitrite/Nitrate峰值濃度相當(dāng))，但能被NOS抑制劑抑制;
　　2.5％ O2輕度缺氧條件下，原代腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞與原代腦星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)后能夠誘導(dǎo)腦星形膠質(zhì)細(xì)胞HIF-1α蛋白水平的上調(diào)，但能被NOS抑制劑抑制;
　　3.5％ O2輕度缺氧條件下，原代腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞與原代腦星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)后能夠上調(diào)腦星形膠質(zhì)細(xì)胞PDK1、LDHA、HK1、HK2、GLUT1、MCT4、VEGF基因轉(zhuǎn)錄，上調(diào)VEGF蛋

15、白表達(dá)和LAC釋放，但能被NOS抑制劑抑制。
　　結(jié)論:
　　在5％ O2輕度缺氧條件下，體外培養(yǎng)的原代大鼠腦星形膠質(zhì)細(xì)胞未感受到低氧，而此低氧條件下給予NO供體藥物和共培養(yǎng)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞均能夠使腦星形膠質(zhì)細(xì)胞感受到低氧，并上調(diào)HIF-1α下游的與無氧糖酵解、葡萄糖和乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)、血管新生等低氧代償作用相關(guān)的酶或因子的基因轉(zhuǎn)錄或表達(dá);對照清除NO或抑制NO生成，以及干擾HIF-1α基因轉(zhuǎn)錄的結(jié)果表明，NO通過阻斷HIF-1α的