精氨酸加壓素調(diào)控AQP4介導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞水通透性的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究.pdf

1、目的：構(gòu)建綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)識(shí)的水通道蛋白-4（AQP4）及其突變體示蹤系統(tǒng)，利用激光共聚焦技術(shù)，建立表達(dá)AQP4及其突變體的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞水通透性的評(píng)價(jià)系統(tǒng)，并利用該系統(tǒng)探討精氨酸加壓素（AVP）對(duì)AQP4水通透性的調(diào)控及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　 方法：依據(jù)大鼠AQP4-M23的cDNA序列和質(zhì)粒pEGFP-C1多克隆位點(diǎn)（MCS）的特點(diǎn)設(shè)計(jì)引入合適的內(nèi)切酶序列的引物，通過(guò)RT-PCR法獲取AQP4-M23的DNA序列，凝

2、膠電泳鑒定；利用pMD○R20-T克隆載體通過(guò)T-A克隆擴(kuò)增AQP4-M23，并進(jìn)行基因測(cè)序鑒定；酶切T-A克隆所得AQP4-M23與pEGFP-C1質(zhì)粒進(jìn)行連接反應(yīng)，完成pEGFP-C1-AQP4-M23的構(gòu)建，鑒定正確后，擴(kuò)增、提取純化融合質(zhì)粒。設(shè)計(jì)將AQP4-M23的第111位和180位的絲氨酸突變?yōu)楸彼岬囊飳?duì)，利用Muta-directTM定點(diǎn)突變?cè)噭┖型ㄟ^(guò)PCR技術(shù)使特定位點(diǎn)突變，構(gòu)建pEGFP-C1-S111A-AQP4

3、-M23和pEGFP-C1-S180A-AQP4-M23兩種含突變位點(diǎn)的融合質(zhì)粒。
　　 水通透性測(cè)定：依據(jù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將構(gòu)建的融合質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染不表達(dá)AQP4的CTX-TNA2星形膠質(zhì)細(xì)胞，37℃、5％C02、完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24h使目的蛋白表達(dá)。利用激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）成像技術(shù)記錄GFP熒光圖像，以確定細(xì)胞表達(dá)與不表達(dá)目的蛋白，然后記錄不同干預(yù)條件下，鈣黃綠素?zé)晒鈴?qiáng)度的變化，利用LSCM的脫機(jī)圖像分析軟件LAS A

4、F Lite和免費(fèi)圖像處理軟件Image J l。42對(duì)脫機(jī)圖像進(jìn)行處理，分析GFP在細(xì)胞上的分布，觀察V1aR激動(dòng)擠Arg8-Vasoticin對(duì)AQP4定位的影響。選擇表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞及其周圍不表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞作為觀察對(duì)象，分析換低滲環(huán)境前后不同時(shí)間點(diǎn)和不同干預(yù)條件下Calcein熒光強(qiáng)度的變化，取PBS由等滲液到換成低滲液即刻及其后10s內(nèi)的熒光變化曲線作為分析對(duì)象，計(jì)算熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的速度，即時(shí)間導(dǎo)數(shù)τ，代表細(xì)胞水腫的速

5、度，本實(shí)驗(yàn)中以-τ表細(xì)胞膜對(duì)水的通透性的大小，以判斷不同干預(yù)條件下AQP4-M23及其突變體對(duì)水的通透性。
　　 結(jié)果：
　　 1.基于GFP標(biāo)識(shí)的AQP4-M23及其突變體示蹤系統(tǒng)的建立
　　 以SD大鼠腦組織總RNA為模板，利用自行設(shè)計(jì)的包含相應(yīng)酶切位點(diǎn)序列的引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增AQP4-M23產(chǎn)物的凝膠電泳凝膠見(jiàn)大小正確的條帶，T-A克隆擴(kuò)增目的基因后測(cè)序，比對(duì)基因測(cè)序結(jié)果和基因庫(kù)數(shù)據(jù)可見(jiàn)測(cè)序圖中序號(hào)為

6、24-929的堿基共計(jì)906個(gè)堿基和AQP4-M23序列完全一致，并在序列前后正確引入了內(nèi)切酶HindⅢ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)的序列，通過(guò)RT-PCR技術(shù)準(zhǔn)確獲取了AQP4-M23全長(zhǎng)序列。利用基因重組技術(shù)連接真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1和所獲得的含有合適酶切位點(diǎn)的AQP4-M23序列后，酶切證實(shí)目的基因（AQP4-M23）以正確方式插入質(zhì)粒pEGFP-C1的MCS中。以融合質(zhì)粒pEGFP-C1-AQP4-M23為模板，設(shè)計(jì)引物改變相應(yīng)突變

7、位點(diǎn)堿基通過(guò)PCR技術(shù)分別實(shí)現(xiàn)S111和S180兩個(gè)氨基酸殘基對(duì)應(yīng)堿基的突變，基因測(cè)序圖譜分別示S111對(duì)應(yīng)的堿基AGC突變?yōu)镚CC、S180對(duì)應(yīng)的堿基TCC突變?yōu)镚CC。RT-PCR證實(shí)，CTX-TNA2星形膠質(zhì)細(xì)胞系不表達(dá)內(nèi)源性AQP4。LSCM掃描結(jié)果示，GFP標(biāo)記于AQP4-M23的氨基端，不影響AQP4-M23定位在胞膜上，融合蛋白在細(xì)胞膜上表達(dá)，均勻分布，胞漿內(nèi)僅痕量表達(dá)；S111和S180突變?yōu)楸彼岷蟛挥绊懲蛔凅w在細(xì)胞膜

8、上的定位。下調(diào)儀器增益可消除GFP的熒光對(duì)鈣黃綠素?zé)晒鈴?qiáng)度測(cè)量的影響。表達(dá)了GFP標(biāo)記的AQP4-M23的CTX-TNA2細(xì)胞，隨蛋白表達(dá)量的增加，細(xì)胞膜對(duì)水的通透性增加，GFP熒光強(qiáng)度增加到一定程度后，進(jìn)一步增加時(shí)，細(xì)胞膜對(duì)水的通透性未出現(xiàn)明顯增加。
　　 2.AVP對(duì)AQP4-M23水通透性的影響
　　 本實(shí)驗(yàn)中Arg8-vasotocin未改變轉(zhuǎn)染了pEGFP-C1-AQP4-M23融合質(zhì)粒的CTX-TNA2星形膠

9、質(zhì)細(xì)胞GFP熒光強(qiáng)度及其在細(xì)胞膜及胞漿內(nèi)分布。表達(dá)AQP4-M23的CTX-TNA2細(xì)胞對(duì)水的通透性明顯增加，達(dá)5倍左右（P<0。Ol）；Arg8-vasotocin對(duì)不表達(dá)AQP4-M23的CTX-TNA2細(xì)胞對(duì)水的通透性無(wú)影響（P＞0。05）：Arg8-vasotocin處理使表達(dá)AQP4-M23的CTX-TNA2細(xì)胞對(duì)的水通透性進(jìn)一步增加（P<0。01）；在Arg8-vasotocin處理前先加CaMKⅡ抑制劑KN-62預(yù)處理，可

10、阻斷Arg8-vasotocin的這種作用，在Arg8-vasotocin處理前先加PKC抑制劑BISI預(yù)處理，使表達(dá)AQP4-M23的CTX-TNA2細(xì)胞對(duì)的水通透性略有增加，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0。05）。
　　 3.S111突變對(duì)AQP4-M23水通透性及AVP干預(yù)的影響
　　 和表達(dá)了AQP4-M23的CTX-TNA2細(xì)胞相比，AQP4-M23第111位的絲氨酸突變?yōu)楸彼岷髮?duì)水的通透性沒(méi)有明顯的影響；Arg8-

11、vasotocin處理不能使表達(dá)S111A-AQP4-M23的CTX-TNA2細(xì)胞對(duì)的水通透性進(jìn)一步增加，BISI預(yù)處理對(duì)表達(dá)S111A-AQP4-M23的CTX-TNA2細(xì)胞對(duì)水的通透性無(wú)明顯影響（P>0。05）。
　　 4.S180突變對(duì)AQP4-M23水通透性及AVP干預(yù)的影響
　　 和表達(dá)了AQP4-M23的CTX-TNA2細(xì)胞相比，AQP4-M23第180位的絲氨酸突變?yōu)楸彼岷髮?duì)水的通透性沒(méi)有明顯的影響；Ar

12、g8-vasotocin處理仍可使表達(dá)S180A-AQP4-M23的CTX-TNA2細(xì)胞對(duì)的水通透性進(jìn)一步增加（P<0。Ol），KN-62預(yù)處理仍可阻斷Arg8-vasotocin的這種作用（P<0。05）。
　　 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建GFP標(biāo)識(shí)的AQP4及其突變體示蹤系統(tǒng)，建立了表達(dá)AQP4及其突變體的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞水通透性的評(píng)價(jià)系統(tǒng)，AQP4可使星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)水的通透性明顯增加，AVP可通過(guò)激活V1aR增加AQP4對(duì)水的通