尾加壓素Ⅱ?qū)Ψ蝿?dòng)脈平滑肌細(xì)胞膠原合成的影響及其細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　 肺動(dòng)脈高壓是各種原因引起的靜息狀態(tài)下右心導(dǎo)管測(cè)得的肺動(dòng)脈平均壓(meanpulmonaryarterialpressuremPAP)≥25mmHg的一組臨床病理生理綜合癥。先天性心臟病是小兒最常見(jiàn)的心臟病，在1000個(gè)出生存活嬰兒中，發(fā)生本病者約6～8名，中國(guó)每年大約有15萬(wàn)新生嬰兒患有各種類型的先天性心臟病(congenitalheartdisease，CHD)，而肺動(dòng)脈高壓是CHD常見(jiàn)且嚴(yán)重的并發(fā)癥。

2、房間隔缺損(atrialseptaldefect，ASD)、室間隔缺損(ventricularseptaldefect，VSD)及動(dòng)脈導(dǎo)管未閉(patentductusarteriosus，PDA)是兒童常見(jiàn)左向右分流型CHD，隨著病情進(jìn)展，肺循環(huán)血流量持續(xù)增加，逐漸形成肺動(dòng)脈高壓，發(fā)展成為艾森曼格(Eisenmenger)綜合癥，伴有肺動(dòng)脈高壓的CHD患者手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)性及死亡率明顯增加，甚至失去手術(shù)機(jī)會(huì)。目前對(duì)肺動(dòng)脈高壓尚無(wú)有效的治療方法

3、。肺動(dòng)脈高壓的特征性病理改變?yōu)榉窝苁湛s反應(yīng)增強(qiáng)及肺血管結(jié)構(gòu)重建。肺血管收縮反應(yīng)增強(qiáng)屬功能性改變，是可逆的;肺血管結(jié)構(gòu)重建是肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞肥大、增殖及膠原等細(xì)胞外間質(zhì)沉積引起肺血管管壁增厚，管腔狹窄，屬結(jié)構(gòu)性改變，是不可逆的。
　　 近二十多年來(lái)，UⅡ(UrotensinⅡ，UⅡ)從1985年自硬骨魚尾垂腺中分離出到如今作為人類心血管疾病病理生理過(guò)程中的一種重要調(diào)節(jié)因子而被廣泛關(guān)注。研究證實(shí)體內(nèi)一種孤立的G蛋白藕聯(lián)受體—GPR

4、14是UⅡ的特異性受體(UT)，UⅡ及其受體廣泛分布于人體的心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腎臟、胰腺等多種組織。UⅡ與UT結(jié)合，能夠引起一系列生物學(xué)效應(yīng)，包括血管收縮，促血管平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及癌細(xì)胞的增殖及細(xì)胞的遷移等。UⅡ在肺動(dòng)脈高壓形成過(guò)程中起重要作用，且目前已發(fā)現(xiàn)UT受體特異性抑制劑Urantide，可以拮抗UⅡ的上述作用。但UⅡ及其受體拮抗劑Urantide對(duì)培養(yǎng)的Wistar大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖及其對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞Ⅰ、

5、Ⅲ型膠原合成的影響尚未見(jiàn)報(bào)道，UⅡ及其受體拮抗劑Urantide調(diào)節(jié)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞膠原合成的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　 本研究的目的:
　　 研究尾加壓素Ⅱ(UrotensinⅡ，UⅡ)及其受體拮抗劑Urantide對(duì)培養(yǎng)的大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs)增殖及Ⅰ、Ⅲ型膠原(collagenⅠ、Ⅲ)合成的影響，探討細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶途徑(extracellularsignal-regulatedkinas

6、e1/2，ERK1/2)是否參與了促肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖及膠原合成增加過(guò)程。為Urantide通過(guò)阻止UⅡ的促增殖作用來(lái)實(shí)現(xiàn)其延緩肺動(dòng)脈高壓發(fā)生發(fā)展的說(shuō)法提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.動(dòng)物選擇:取120g左右健康雄性Wistar大鼠，行肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞分離并進(jìn)行原代培養(yǎng)，經(jīng)Rabbitanti-α-actin單克隆抗體及FITC免疫熒光進(jìn)行細(xì)胞鑒定。
　　 2.肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng):以組織貼塊法培養(yǎng)

7、的大鼠PASMCs為研究對(duì)象，分為不同實(shí)驗(yàn)組:①UⅡ作用組:將不同濃度(10-10mol/L～10-7mol/L)UⅡ加入細(xì)胞培養(yǎng)孔，（每個(gè)濃度n=5），觀察UⅡ?qū)ASMCs增殖的影響;②Urantide阻斷組:10-7mol/LUrantide作用30min后加入10-7mol/LUⅡ繼續(xù)作用24h(n=5)，觀察Urantide對(duì)UⅡ的拮抗作用;③PD98059抑制組:10-5mol/LPD98059作用30min后加入10-7m

8、ol/LUⅡ繼續(xù)作用2h(n=5)，觀察PD98059對(duì)磷酸化ERK1/2的抑制作用;④對(duì)照組:未加入U(xiǎn)Ⅱ及其受體拮抗劑(n=5)。
　　 3.培養(yǎng)PASMCs增殖:采用CCK-8法及BrdU摻入實(shí)驗(yàn)測(cè)定UⅡ及Urantide對(duì)培養(yǎng)大鼠PASMCs增殖的影響。
　　 4.實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)UⅡ及Urantide對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原及p-ERK1/2基因表達(dá)的影響，同時(shí)測(cè)定PD98059對(duì)p-ERK1/2基因表達(dá)

9、的影響。
　　 5.Westernblotting測(cè)定UⅡ及Urantide對(duì)培養(yǎng)大鼠PASMCsⅠ、Ⅲ膠原及磷酸化ERK1/2蛋白表達(dá)的影響，同時(shí)檢測(cè)PD98059對(duì)磷酸化ERK1/2蛋白表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.本研究通過(guò)組織貼塊法成功原代培養(yǎng)出肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，經(jīng)Rabbitanti-α-actin單克隆抗體及FITC免疫熒光對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，其純度達(dá)95％。
　　 2.CCK-8細(xì)

10、胞生長(zhǎng)測(cè)定及BrdU摻入實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:不同濃度的UⅡ(10-9mol/L～10-7mol/L)可濃度依賴性地促進(jìn)PASMCs的增殖(P＜0.05，P＜0.001)，其中UⅡ(10-7mol/L)，促增殖作用最明顯(P＜0.001);UⅡ(10-10mol/L)無(wú)明顯促細(xì)胞增殖作用(P＞0.05)。Real-timePCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn):UⅡ濃度依賴性地增加PASMCsⅠ、Ⅲ型膠原基因表達(dá);Westernblotting結(jié)果顯示:UⅡ可濃度

11、依賴性地增加PASMCsⅠ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)(P＜0.05，P＜0.001)。其中UⅡ(10-7mol/L)，促膠原合成作用最明顯(P＜0.001)，UⅡ(10-10mol/L)無(wú)明顯促膠原合成作用(P＞0.05)。
　　 3.Real-timePCR及Westernblotting分別從基因及蛋白水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn):UⅡ可誘導(dǎo)ERK1/2磷酸化，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶抑制劑PD98059可顯著抑制磷酸化ERK1/2基因及蛋白表達(dá)(P＜0

12、.05，P＜0.001)。
　　 4.UⅡ受體拮抗劑Urantide可抑制UⅡ的促肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖，促Ⅰ、Ⅲ型膠原合成作用及誘導(dǎo)ERK1/2磷酸化作用。(P＜0.01，P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.本研究成功分離并培養(yǎng)了大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞純度達(dá)95％。是良好的實(shí)驗(yàn)材料，提高了實(shí)驗(yàn)的可行性及準(zhǔn)確性。
　　 2.UⅡ濃度依賴性地促進(jìn)PASMCs增殖，增加PASMCsⅠ、Ⅲ膠原的基因