硼替佐米通過調(diào)節(jié)肺動脈平滑肌細胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)治療肺動脈高壓.pdf

1、【研究背景】肺動脈高壓(PH)是多種病因?qū)е碌姆蝿用}血管床破壞，血管重構(gòu)，循環(huán)阻力增加，從而導(dǎo)致右心壓力負荷增高，進而導(dǎo)致右心衰竭的綜合征。是多種循環(huán)、呼吸、代謝等系統(tǒng)疾病發(fā)生、發(fā)展的重要病理生理過程。肺動脈高壓患者約75％在診斷后5年內(nèi)死亡，癥狀出現(xiàn)后平均生存期約1.9年；有右心衰表現(xiàn)者，平均生存時間小于1年。肺動脈高壓危害大，預(yù)后差。其肺血管的基本病理變化，早期以肺動脈收縮為主，后期以肺動脈重塑為主。目前，關(guān)于肺動脈高壓的發(fā)病機制尚

2、不完全清楚。研究表明，肺動脈平滑肌細胞(PASMCs)內(nèi)鈣離子濃度（[Ca2+]i）在肺動脈高壓發(fā)病過程中扮演重要的角色。細胞內(nèi)Ca2+與鈣調(diào)蛋白（CaM）結(jié)合，形成Ca2+-CaM復(fù)合物，該復(fù)合物結(jié)合胞質(zhì)內(nèi)的肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK），并使之活化?；罨腗LCK磷酸化粗肌絲原肌球蛋白橫橋的肌球蛋白輕鏈（MLC），磷酸化的MLC（P-MLC）激活橫橋的ATP酶，水解ATP釋放能量引發(fā)肌絲滑動，導(dǎo)致平滑肌收縮。細胞內(nèi)Ca2+還可激活鈣依

3、賴激酶（如鈣調(diào)蛋白激酶，CaMK）和某些轉(zhuǎn)錄因子[如c-Fos，激活的T細胞的核因子(NFAT), cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)]等，促使休眠期細胞進入增殖期，引起PASMCs增殖。
　　細胞內(nèi)鈣離子濃度的升高通常通過以下途徑實現(xiàn)：1）細胞內(nèi)細胞器（如肌質(zhì)網(wǎng)）儲存鈣的釋放；2）細胞膜鈣 ATP酶（Ca2+-ATPases）及鈉鈣交換體（Na+/Ca2+ exchangers）介導(dǎo)的細胞外液鈣離子內(nèi)流；3）細胞膜鈣離子通道介

4、導(dǎo)的細胞外液鈣離子內(nèi)流。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的細胞膜鈣離子通道主要有受體操縱性鈣通道（ROCCs）、電壓依賴性鈣通道（VDCCs）和鈣池操縱性鈣通道（SOCCs）。本課題組及其他學者的研究發(fā)現(xiàn)，在低氧誘導(dǎo)的[Ca2+]i升高過程中，SOCC而不是VDCC起主導(dǎo)作用。
　　泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system）是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的主要途徑，該途徑包括底物蛋白質(zhì)的泛素化和蛋白酶體降解兩個過程。底物蛋白質(zhì)

5、經(jīng)泛素活化酶E1、泛素載體蛋白E2、泛素連接酶E3的催化作用而被多聚泛素化。多聚泛素鏈作為一種標簽，可以被26S蛋白酶體識別，進而被26S蛋白酶體降解。研究表明，在多種疾病尤其是增生性疾病，存在蛋白酶體活性增強。作為一個新的治療靶點26S蛋白酶體受到廣泛關(guān)注。硼替佐米（BTZ）是第一個用于臨床的蛋白酶體抑制劑，用于治療多發(fā)性骨髓瘤取得了良好的療效。近年來，有研究表明BTZ可明顯緩解動物模型肺動脈高壓的進展。其機制可能與上調(diào)內(nèi)皮源性一氧化

6、氮合酶（eNOS)，促進一氧化氮（NO）磷酸化，進而增加NO的合成以及上調(diào)核因子-jB抑制物(I-κBα)等有關(guān)。BTZ下調(diào)核因子-κB（NF-κB)，轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β)和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF)的作用，也有助于肺動脈高壓的治療。
　　BTZ緩解模型動物肺動脈高壓的作用是否與其調(diào)節(jié)PASMCs內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)有關(guān)，尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)研究。本文擬通過BTZ治療肺動脈高壓的具體作用及其對細胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)的影響進一步探討B(tài)TZ治療

7、肺動脈高壓的機制。
　　【研究目的】探討蛋白酶體抑制劑硼替佐米（BTZ）治療低氧及野百合堿（MCT）誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠模型的有效性及其可能的作用機制。
　　【研究方法】分別建立低氧和MCT誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓模型，并予BTZ干預(yù)。21天后測定大鼠右心室壓力（RVP）、右心室肥厚指數(shù)[RV/(LV+S)]。4%多聚甲醛固定肺組織用于 HE染色。分離肺動脈，除去外膜及內(nèi)膜組織，得到肺動脈平滑肌組織。取一部分用于培養(yǎng)PASMCs

8、。24-48h待細胞貼壁后，用鈣離子成像系統(tǒng)測定細胞內(nèi)基礎(chǔ)鈣離子濃度及SOCE。另一部分提取RNA或蛋白，通過熒光定量PCR和免疫印跡法測定肺動脈HIF-1α、BMP4、PPARγ、TRPC1和 TRPC6的表達。
　　分離正常大鼠遠端肺動脈，原代培養(yǎng) PASMCs，通過 BrdU法測定不同濃度 BTZ對 PASMCs增殖的影響，并選擇一合適濃度及藥物作用時間進行細胞內(nèi)基礎(chǔ)鈣離子濃度及SOCE的測定。并通過熒光定量PCR和免疫印跡

9、法測定原代培養(yǎng)的肺動脈平滑肌細胞HIF-1α、BMP4、PPARγ、TRPC1和 TRPC6的表達情況。
　　【研究結(jié)果】成功建立慢性低氧誘導(dǎo)的肺動脈高壓（CHPH）大鼠模型及MCT誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠模型（MCT-PH）。BTZ顯著降低肺動脈高壓大鼠模型的平均右心室壓、右心室收縮壓及右心室肥厚指數(shù)，減輕肺動脈血管壁增厚；BTZ在 mRNA及蛋白水平顯著抑制低氧及 MCT誘導(dǎo)的HIF-1α，BMP4，TRPC1和 TRPC6表達上

10、調(diào)和PPARγ表達下調(diào)；BTZ顯著降低肺動脈高壓模型大鼠肺動脈平滑肌細胞內(nèi)基礎(chǔ)鈣離子濃度及SOCE。
　　在體外原代培養(yǎng)的肺動脈平滑肌細胞，BTZ顯著抑制低氧誘導(dǎo)的原代肺動脈平滑肌細胞增殖，并呈劑量依賴性。BTZ在mRNA及蛋白水平顯著抑制低氧誘導(dǎo)HIF-1α，BMP4，TRPC1和 TRPC6的表達上調(diào)和PPARγ的表達下調(diào)；BTZ顯著降低低氧肺動脈平滑肌細胞內(nèi)基礎(chǔ)鈣離子濃度及SOCE。
　　【結(jié)論】BTZ能夠顯著改善低氧