NAADP激活雙孔通道對(duì)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響.pdf

1、目的：探索人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中是否存在NAADP通過激活TPC1和TPC2誘導(dǎo)鈣釋放這一信號(hào)通路，并研究其誘導(dǎo)鈣釋放的基本機(jī)制。
　　方法：RT-PCR及蛋白印記測(cè)定人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中TPC1及TPC2的表達(dá)；使用能透膜的NAADP-AM研究人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞上不同濃度NAADP對(duì)鈣釋放的影響；Ned-19抑制NAADP對(duì)鈣釋放的影響；當(dāng)細(xì)胞外為零鈣時(shí)研究NAADP對(duì)鈣釋放的影響；研究Bafilomycin A1抑制空泡H-AT

2、P酶以阻斷溶酶體上Ca/H交換來耗竭酸性鈣儲(chǔ)存后NAADP對(duì)鈣釋放的影響；Xestospongin C和Ryanodine分別阻斷InsP3受體和RyR受體后NAADP對(duì)鈣釋放的影響。
　　結(jié)果：
　　1.使用實(shí)時(shí)定量RT-PCR測(cè)定TPC1和TPC2 mRNA，證實(shí)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞觀察到TPC1和TPC2 mRNA表達(dá)。
　　2.NAADP-AM以濃度依賴性調(diào)節(jié)胞漿Ca2+濃度。當(dāng)NAADP-AM的濃度分別為0.2

3、5μM和0.5μM時(shí)胞漿鈣濃度持續(xù)增加，當(dāng)為1μM時(shí)，引起一個(gè)雙相性反應(yīng)，表現(xiàn)為在一個(gè)初始相增高峰后接著出現(xiàn)一段平臺(tái)期。1μM NAADP-AM引起鈣釋放反應(yīng)不受零鈣溶液的影響。
　　3.Ned-19(100μM）預(yù)處理人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞20分鐘阻斷了NAADP-AM誘導(dǎo)鈣反應(yīng)的初始峰值并且顯著降低持續(xù)相鈣濃度(對(duì)照組,285.1±25.2nM(n=6),Ned-19組,134.9±11.2nM(n=6),p<0.01)。

4、　　4.人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞外生理濃度鈣時(shí)為228.9±19.7(n=5),零鈣時(shí)為222.1±18.4nm(n=5),。
　　5.用Bafilomycin A1預(yù)處理人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞1小時(shí)，幾乎完全阻斷NAADP-AM（1μM）調(diào)控Ca2+在平均鋒期和平臺(tái)期的釋放，對(duì)照組的平均峰值為186.4±16.9nM(n=5),BafilomycinA1預(yù)處理human PASMCs組平均峰值為81.4±8.8nM(n=5;p<0.05)

5、。
　　6.用Xestospongin C預(yù)處理細(xì)胞后鈣釋放峰值無變化。
　　7.Ryanodine預(yù)處理細(xì)胞后鈣釋放的平均峰值部分減少，而持續(xù)相無變化。
　　結(jié)論：
　　1.人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞上存在TPC1和TPC2，并且以TPC1的表達(dá)為主。
　　2.NAADP呈濃度依賴性誘導(dǎo)鈣釋放。
　　3.NAADP誘導(dǎo)鈣釋放主要來自于胞內(nèi)鈣儲(chǔ)存，且很大可能性這個(gè)鈣釋放來自于內(nèi)溶酶體系統(tǒng)。
　　4.NA