自發(fā)性高血壓大鼠冠狀動脈平滑肌細(xì)胞大電導(dǎo)鈣激活鉀離子通道的研究.pdf

1、目的：冠狀動脈壁張力升高和冠脈循環(huán)阻力上升是誘發(fā)心絞痛的重要因素。造成冠脈張力上升的因素有多種，其中血壓升高是重要因素之一。升高的血壓施加于管壁，使血管平滑肌張力上升，機(jī)體通過復(fù)雜的自適應(yīng)機(jī)制，啟動血管舒張機(jī)制，以平衡和維持冠狀動脈循環(huán)的動態(tài)平衡。目前，高血壓背景下冠狀動脈的適應(yīng)性舒張機(jī)制尚未明確。本研究選取自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)為高血壓模型，應(yīng)用電生理膜片鉗技術(shù)和分子生物學(xué)手段，研究高血壓大鼠冠狀動脈平滑肌細(xì)胞(CASMCs)大電

2、導(dǎo)鈣激活電壓依賴性鉀離子通道(BK)，以及BK通道的表達(dá)，并與正常血壓組對照，闡明高血壓大鼠CASMCs復(fù)極電流是否發(fā)生適應(yīng)性增加，并探討舒張機(jī)制在維持冠脈循環(huán)中的重要地位。
　　 方法：
　　 (1)、采用“三步”酶消化法，即含0.125％牛血清白蛋白(Bovineserumalbumin，BSA)緩沖液室溫孵育10分鐘，酶液I消化10-20分鐘，酶液II消化10-15分鐘。
　　 (2)、分離大鼠冠狀動脈平滑

3、肌細(xì)胞后，應(yīng)用膜片鉗全細(xì)胞記錄模式記錄高血壓和正常SD大鼠冠狀動脈平滑肌細(xì)胞鉀電流，分析大鼠CASMCs上主要的鉀流成分及一般特性。
　　 (3)、記錄并比較SHR和WKY大鼠CASMCs上BK電流以及BK尾電流的大小。
　　 (4)、提取SHR和WKY大鼠冠狀動脈平滑肌細(xì)胞的RNA，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，利用相對定量和半定量的方法比較高血壓大鼠和正常大鼠的BK通道α和p1亞基的mRNA水平。
　　 (5)、提取并純化S

4、HR和WKY大鼠的冠狀動脈平滑肌膜蛋白，采用免疫組化和western-blot方法對高血壓大鼠和正常血壓大鼠BK通道α和β1亞基的蛋白水平進(jìn)行比較。
　　 結(jié)果：
　　 (1)、電生理結(jié)果
　　 ①WKY大鼠(n=82)平均體重為310+13.2克，平均尾動脈收縮壓為112.39+13.17mmHg，SHR(n=61)平均體重270±15.5克，平均尾動脈收縮壓為172.057±20.13mmHg。SHR大鼠和W

5、KY大鼠的平均靜息電位大小分別為-31.7±4.53mV(n=6)和-49.8+5.11mV(n=6,P＜0.05).
　　 ②SHR的平均電容為12.4+2.8pf(n=24)，WKY大鼠的平均電容為13.8+3.2pf(n=25)，兩組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(p=0.117)。
　　 ③在電壓鉗模式下，從鉗制電壓(HoldingPotential，HP)-60毫伏(mV)逐步除極至+120mV，階躍+10mV，維持時間40

6、0ms，刺激頻率5kHz，在測試電壓(TestPotential，TP)+120mv,+110mv,+100mv,+90mv下得到SHR大鼠的電流密度為(pA/pF)213.08±28.14、161.67±19.51，120.24±11.92，84.45±10.17;WKY大鼠的相應(yīng)電流密度為(pA/pF)203.82±19.53，150.31±17.26，127.39±14.70，97.54±10.37；兩者比較無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(p＞

7、0.05)。
　　 ④在0nMIBTX時，SHR大鼠(n=6)冠脈平滑肌細(xì)胞電流密度如前述，在加入lOOnMIBTX后相同刺激程序記錄結(jié)果相應(yīng)為(pA/pF)59.46±8.17，38.19±5.79，29.94±4.46，19.92±1.41，平均下降百分比為72.6％、76.8％、76.8％、78.6％，相比較有顯著性差異(p＜0.01)；WKY(n=7)大鼠加入100nMIBTX后的各組值為(pA/pF)135.52±10

8、.69，97.95±10.15，81.93±9.50，66.42±5.31，平均下降百分比為33.503％、34.834％、35.688％、31.868％，相比有顯著差異(p＜0.05)。SHR大鼠和WKY大鼠加入IOOnMIBTX后平均電流密度分別下降69.82±5.25％和34.32±1.87％，SHR組下降幅度是WKY組的2.03±0.62倍，具有顯著差異(p＜0.01)，提示SHR大鼠的CASMCs上外向電流中對IBTX敏感的B

9、K電流增大了。
　　 ⑤在電極外液先加入3mM4-AP的作用下所記錄到的以BK為主要成分的鉀離子電流：+120mv,+llomv,+100mv,+90mv時，SHR大鼠的電流密度為（pA/pF）110.55±10.53，88.08±7.27，67.28±5.72，51.48±6.01:WKY大鼠為(pA/pF)54.65±6.11，40.45±2.91，31.29±2.11，21.31±1.93，標(biāo)準(zhǔn)化電流密度SHR組平均值同對

10、應(yīng)電壓下WKY組比較高2.674-1.02倍，有顯著差異(p＜0.01)，與100nMIBTX干預(yù)下所測結(jié)果相似。也反映了SHR大鼠的BK電流加大。
　　 ⑥在尾電流研究中，實驗發(fā)現(xiàn)，在SHR組(n=9)，在+30mv,+40mv,+50mv,+60my,+70mv,+80，+90mv時電流密度值為（pA/pF）31.374-5.61，44.714±7.58，62.41±6.78，71.95±9.07，86.23±9.51，97

11、.12±10.07，113.35±11.22，WKY大鼠組(n=8)的對應(yīng)值分別為(pA/pF)16.414-4.32,23.58±5.11,35.29±4.89,51.67±7.54,66.41±8.12,75.87±8.76,81.01±6.52;SHR組分別比WKY組高47.68％，47.26％，43.44％，28.15％，23.05，21.93％，28.54％，具有顯著差異(p＜0.05)，這也反映了SHR大鼠的BK通道活性增加

12、。
　　 (2)、分子生物學(xué)研究結(jié)果
　　 ①通過相對定量PCR產(chǎn)物的溶解和擴(kuò)增曲線的分析，在mRNA的表達(dá)上GAPDH＞BKα＞BKβ1。應(yīng)用2-AACt的計算方法，得出SHR大鼠的BKβ1亞基的mRNA的表達(dá)是WKY大鼠的5.534±1.03倍，具有顯著差異(n=4，p＜0.05)；而SHR大鼠的BKα亞基的mRNA的表達(dá)是WKY大鼠的1.266±0.12倍，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果與定量PCR一致。
　　 ②免疫

13、組化的結(jié)果則提示了BKα的表達(dá)在SHR表達(dá)略高，但和WKY比無明顯差異；SHR大鼠BKβ1表達(dá)則升高。
　　 ③Western-blot結(jié)果說明，SHR和WKY大鼠BKa亞基蛋白灰度值比為255.98±19.17:251.36±18.51，沒有明顯差異，而β1亞基在兩組大鼠中表達(dá)均很低，SHR大鼠β1亞基同WKY大鼠之比為84.25±12.26：29.74±5.59，具有顯著性差異(p＜0.05)?？梢姀姆肿由飳W(xué)角度上也獲得S

14、HR大鼠的BK通道表達(dá)高于WKY大鼠，由此反映SHR大鼠冠狀動脈平滑肌BK通道結(jié)構(gòu)與功能改變相一致。
　　 結(jié)論：
　　 (1)大鼠冠狀動脈平滑肌細(xì)胞的鉀離子通道主要由BK和Kv組成，分別對IBTX和4-AP敏感。
　　 (2)SHR大鼠的心臟冠狀動脈平滑肌細(xì)胞的BK通道電流明顯高于WKY大鼠。
　　 (3)SHR大鼠的心臟冠狀動脈平滑肌細(xì)胞的靜息電位水平高于(負(fù)值變小)WKY大鼠，更趨去極化，易引起血管