AKT-mTOR-NF-κB增加CXCR4促進大鼠低氧性肺動脈高壓肺動脈平滑肌細胞損傷修復(fù)研究.pdf

1、肺動脈高壓（Pulmonary hypertension，PH）是多種病因?qū)е碌囊淮箢惣膊。饕憩F(xiàn)為肺動脈壓力升高和肺血管阻力增高，進一步發(fā)展至右心衰竭，最終導(dǎo)致死亡。低氧是PH發(fā)生和發(fā)展的一個重要原因，所以低氧性肺動脈高壓（ Hypoxic pulmonary hypertension，HPH）的發(fā)病機制一直是研究熱點。HPH特征性病理表現(xiàn)為肺血管平滑肌細胞增殖和肺血管重構(gòu)。研究肺血管重構(gòu)的分子機制，找出能夠抑制和逆轉(zhuǎn)肺血管重構(gòu)發(fā)生

2、的關(guān)鍵分子通路，進而從根本上防治HPH的發(fā)生和發(fā)展是本課題的研究重點。
　　低氧性肺動脈高壓的肺組織中PI3K/AKT/mTOR信號通路顯著活化，提示該信號通路在HPH中發(fā)揮了重要作用；文獻報道HPH的肺組織中轉(zhuǎn)錄因子NF-κB顯著活化，CXC趨化因子受體-4（CXCChemokinereceptor-4，CXCR4）的表達顯著升高。本課題重點闡述PI3K/AKT/mTOR信號通路與NF-κB活化以及CXCR4高表達之間的內(nèi)在聯(lián)系

3、；明確CXCR4抑制劑對HPH的治療作用，確立CXCR4為新型肺動脈高壓治療的藥物靶點。
　　【目的】
　　①在低氧誘導(dǎo)的肺動脈平滑肌細胞（Pulmonary arterial smooth cells，PASMCs）中，闡明PI3K/AKT/mTOR信號通路與NF-κB、CXCR4的關(guān)系及具體的分子機制。
　?、诿鞔_PI3K/AKT/mTOR信號通路及NF-κB、CXCR4在HPH肺血管平滑肌細胞遷移中的作用。

4、>　?、勖鞔_CXCR4抑制劑對肺動脈高壓的治療作用，確立CXCR4為肺動脈高壓新型治療藥物靶點。
　　【方法和結(jié)果】
　?、傥覀兪紫扔门囵B(yǎng)的原代PASMCs，模擬細胞損傷修復(fù)模型，給予低氧刺激后發(fā)現(xiàn)與常氧組對比低氧刺激可以促進細胞的遷移。進一步建立低氧誘導(dǎo)的PASMCs損傷修復(fù)模型，分別加入PI3K/mTOR雙抑制劑BEZ-235、mTORC1/C2雙抑制劑OSI-027、mTORC1抑制劑 Rapamycin,，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細

5、胞遷移均受抑制。也就是說PI3K/AKT/mTOR信號通路對低氧誘導(dǎo)的PASMCs的遷移起到促進作用。
　?、谟肧D大鼠建立低壓低氧性肺動脈高壓模型，4周后測定其右心室壓力及右心室肥厚指標(biāo)均較常氧組升高；各組肺小血管HE染色提示低氧組肺小血管管壁增厚。各組大鼠肺組織提取蛋白行Western-blot檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AKT、mTOR與NF-κB在大鼠HPH肺組織中是活化的。
　?、劢o予PASMCs低氧刺激后提蛋白行Western

6、 blot檢測，發(fā)現(xiàn)與常氧組對比AKT、mTOR和NF-κB蛋白的磷酸化水平均增高。接著我們給予低氧誘導(dǎo)的PASMCs加入PI3K/AKT的抑制劑LY294002，mTOR和NF-κB蛋白的磷酸化水平均受抑制；而加入mTORC1的抑制劑Rapamycin后NF-κB的磷酸化水平受抑制，AKT的磷酸化水平無明顯變化；靶向抑制mTOR及mTORC1的構(gòu)架蛋白Raptor后，得到了同樣的結(jié)論。提示我們，在低氧誘導(dǎo)的PASMCs中，AKT/mT

7、OR信號通路促進NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的活化。
　　④我們在低氧誘導(dǎo)的PASMCs，采用免疫共沉淀方法確定了mTOR與IKKα可以相結(jié)合。靶向抑制低氧誘導(dǎo)的PASMCs細胞中的Raptor蛋白表達后，再用免疫共沉淀的技術(shù)免疫沉淀mTOR，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IKKα是特異性結(jié)合mTORC1的。
　　⑤我們用原代培養(yǎng)的PASMCs，給予低氧刺激后行Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)與常氧組對比IKKα/β、IKBα的磷酸化水平增高。若給予低氧處

8、理的同時加入mTORC1的抑制劑Rapamycin后IKKα/β的磷酸化水平受抑制，靶向抑制mTORC1后，得到同樣結(jié)果。接著我們靶向抑制IKKα/β活性，發(fā)現(xiàn)IKBα和NF-κB蛋白的磷酸化水平與低氧對照組相比受抑制，這提示我們，在低氧誘導(dǎo)的PASMCs中， mTORC1活化了IKKα/β，IKKα/β的激活又使得下游分子IKBα和NF-κB進一步激活。
　　⑥我們接下來在低氧誘導(dǎo)的PASMCs中，靶向抑制NF-κB的表達后CX

9、CR4蛋白水平與低氧對照組相比下降；而過表達NF-κB后，CXCR4蛋白水平與低氧對照組相比增高。同樣我們采用RT-PCR的方法檢測NF-κB對CXCR4轉(zhuǎn)錄水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CXCR4轉(zhuǎn)錄水平的表達同樣受到NF-κB的調(diào)控。接著，我們在建立的低氧誘導(dǎo)的PASMCs損傷修復(fù)模型中，給予CXCR4的抑制劑AMD3100或者靶向抑制CXCR4后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制CXCR4的表達對低氧誘導(dǎo)的PASMCs損傷修復(fù)有抑制作用。這說明在低氧誘導(dǎo)的PA

10、SMCs中，NF-κB的活化調(diào)節(jié)CXCR4高表達進而促進低氧誘導(dǎo)的PASMCs的損傷修復(fù)。
　?、咴趧游锼轿覀凃炞CCXCR4在大鼠HPH中的作用。首先我們用Western blot技術(shù)及免疫組化染色技術(shù)均證明了CXCR4在大鼠低氧性肺動脈高壓中是高表達的。在低壓低氧處理大鼠的同時給予CXCR4的抑制劑AMD3100，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AMD3100注射組大鼠mRVP明顯較低氧組降低、右心室肥厚指標(biāo)明顯下降，肺組織HE染色提示，與低氧組相比

11、肺小血管壁肥厚程度也明顯減輕。由此得出結(jié)論：CXCR4抑制劑AMD3100可以抑制大鼠HPH形成，抑制肺血管與右心系統(tǒng)的重構(gòu)。
　　【結(jié)論】
　　通過本課題的研究，我們證實了AKT/mTOR信號通路活化可促進PASMCs的損傷修復(fù)；在低氧誘導(dǎo)的PASMCs中，我們發(fā)現(xiàn)mTORC1通過磷酸化調(diào)節(jié)IKKα/β使得NF-κB活化，活化的NF-κB又進一步促進CXCR4的表達；CXCR4可促進PASMCs的損傷修復(fù)與細胞遷移，CXC