APOE基因多態(tài)性影響p38MAPK信號通路介導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞創(chuàng)傷后炎性損傷的實驗研究.pdf

1、創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）占全身創(chuàng)傷發(fā)生率第2位，但死殘率則處于第1位。在我國，每年所造成的直接和間接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)100億元以上，已成為嚴(yán)重的社會公害，始終是廣大神經(jīng)科學(xué)者不斷探索的課題。載脂蛋白E基因（apolipoprotein E，APOE，apoE為其蛋白）有ε2、ε3、ε4三種等位基因，國外研究以及本課題組前期工作顯示，ε4攜帶者對腦損傷的耐受性低，更易出現(xiàn)傷情加重及不良預(yù)后。但是，A

2、POE影響腦損傷病情轉(zhuǎn)歸的機(jī)制尚未闡明。究其根本，apoE通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)的運轉(zhuǎn)及代謝發(fā)揮其神經(jīng)生物學(xué)作用，脂質(zhì)代謝和炎癥反應(yīng)的密切聯(lián)系在上世紀(jì)50年代就開始受到國外學(xué)者的關(guān)注，而且APOE本身也能直接促發(fā)全身多系統(tǒng)急、慢性炎癥反應(yīng)。炎癥反應(yīng)在TBI后的病理進(jìn)程中起著重要作用，在修復(fù)損傷組織的同時，由炎癥介導(dǎo)釋放的多種神經(jīng)毒性物質(zhì)導(dǎo)致繼發(fā)性神經(jīng)損傷。據(jù)此我們推測，TBI觸發(fā)的創(chuàng)傷性炎癥反應(yīng)，以及由炎癥反應(yīng)造成的神經(jīng)損傷，因APOE基因型的不

3、同而存在差異，APOEε4攜帶者創(chuàng)傷后炎性損傷程度強(qiáng)于其它兩型，因此造成不良預(yù)后。本課題以APOE亞型特異性與創(chuàng)傷后炎性損傷的關(guān)系作為切入點，構(gòu)建人源性ε2、ε3、ε4的真核表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)染APOE敲除鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞（astrocytes，AS），篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，建立細(xì)胞損傷模型，采用Western Blot、逆轉(zhuǎn)錄-PCR等技術(shù)研究傷后APOE亞型特異性與細(xì)胞早期p38絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated pr

4、otein Kinase，MAPK）-核因子-kappa B（NF-κB）炎癥信號通路表達(dá)的關(guān)系，探討APOE影響繼發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞損傷的作用機(jī)制。
　　 一、人源性APOE基因真核細(xì)胞表達(dá)載體的構(gòu)建、鑒定，以及細(xì)胞損傷模型的建立
　　 人胎腦組織中提取Total RNA后，設(shè)計引物擴(kuò)增APOEε3基因CDS區(qū)域，采用定點突變技術(shù)，得到APOEε2及APOEε4的突變體，將三種目的基因片段分別亞克隆至真核表達(dá)載體pEGFP-

5、N1，構(gòu)建pEGFP-N1-APOE重組質(zhì)粒。對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切、PCR和測序驗證后，采用融細(xì)胞膜類基因轉(zhuǎn)染試劑Trans-EZ將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至APOE敲除鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞，并利用劃痕致傷建立細(xì)胞損傷模型。結(jié)果：雙酶切、PCR和質(zhì)粒測序結(jié)果證明APOE各等位基因正確地克隆到真核表達(dá)載體pEGFP-N1中，并能在星形膠質(zhì)細(xì)胞中進(jìn)行融合表達(dá)。結(jié)論：成功構(gòu)建了人源性pEGFP-N1-APOE各亞型的真核表達(dá)載體，成功轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，并建立細(xì)胞損

6、傷模型。
　　 二、APOE亞型特異性對星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷后早期胞內(nèi)Ca2+濃度及NF-κB表達(dá)的影響
　　 設(shè)置時間點（致傷前、傷后12h、24h、48h、72h），使用激光共聚焦顯微鏡（laser confocal scanning microscope，LCSM）觀察三型細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度，籍此比較不同基因型的星形膠質(zhì)細(xì)胞致傷后受損程度。在相同的時間點，利用逆轉(zhuǎn)錄-PCR及Western Blot技術(shù)觀察三種基

7、因型星形膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB的表達(dá)，籍此比較三種基因型創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)的程度。結(jié)果：自傷后24h起，APOEe4型細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度要顯著高于ε2和ε3型（P<0.05）；與之對應(yīng)的是，ε4型星形膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB的表達(dá)要顯著高于其它兩種基因型（P<0.05）。結(jié)論：APOEε4傷后早期NF-κB的高表達(dá)及由此造成的細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高顯著異于其它兩種基因型，這可能是其導(dǎo)致不良預(yù)后的原因之一。
　　 三、p38MAPK炎癥信

8、號通路對不同APOE亞型星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷后NF-κB的差異性表達(dá)的影響
　　 于致傷前、傷后12h、24h、48h、72h，利用逆轉(zhuǎn)錄-PCR及WesternBlot技術(shù)觀察三種基因型星形膠質(zhì)細(xì)胞p38MAPK的表達(dá)；同時使用p38MAPK特異性抑制劑SB203580，觀察抑制前后，三型細(xì)胞NF-κB的表達(dá)變化，籍此探討p38MAPK炎性信號通路是否在更上游參與APOE亞型對顱腦創(chuàng)傷的影響。結(jié)果：APOEε4型星形膠質(zhì)細(xì)胞p38