p38MAPK與脊髓星形膠質(zhì)細胞活化的關(guān)系及參與慢性前列腺炎疼痛的實驗研究.pdf

1、背景：慢性前列腺炎(chronic prostatitis，CP)是泌尿外科最常見疾病之一，該病病因、病理改變、臨床癥狀復(fù)雜多樣，其中疼痛是慢性前列腺炎患者最主要的癥狀。盡管前列腺炎一般不會對生命造成威脅，但可嚴重影響患者生活質(zhì)量，尤其是對患者精神健康的影響比嚴重的糖尿病和慢性心力衰竭更為明顯。由于慢性前列腺炎病因復(fù)雜，治療困難，雖已有大量的基礎(chǔ)和臨床研究，但至今尚無突破性進展。因此，從疼痛機理研究入手，有望開創(chuàng)新的慢性前列腺炎治療方法

2、。由于前列腺疼痛呈現(xiàn)內(nèi)臟牽涉痛特點，目前認為前列腺疼痛的持續(xù)與泛化與支配前列腺的L5～S2脊髓段的繼發(fā)性病變有關(guān)。 在慢性前列腺炎L5～S2脊髓段的繼發(fā)性病變研究中，發(fā)現(xiàn)除神經(jīng)元外，神經(jīng)膠質(zhì)細胞具有較大作用。神經(jīng)膠質(zhì)細胞是神經(jīng)系統(tǒng)中除神經(jīng)元以外的第二大類細胞，廣泛分布于腦和脊髓。近年來發(fā)現(xiàn)，痛覺的傳導(dǎo)和調(diào)制不僅僅是神經(jīng)元的功能，活化的星形膠質(zhì)細胞也通過和神經(jīng)細胞的相互作用及炎性因子的分泌而參與病理性疼痛的發(fā)生。星形膠質(zhì)細胞功能受

3、許多神經(jīng)體液因子的調(diào)節(jié)，目前引起廣泛重視的有p物質(zhì)(substance P，SP)、谷氨酸和各種炎性因子等，周圍慢性疼痛可通過這些遞質(zhì)和生物因子的作用影響脊髓星形膠質(zhì)細胞功能，從而參與慢性疼痛在脊髓初級中樞的傳導(dǎo)和調(diào)制。SP不僅作為神經(jīng)遞質(zhì)向中樞傳遞來自外界的物理、化學(xué)和溫度等傷害性刺激，具有導(dǎo)致疼痛的作用，同時還可在接受刺激信號后由神經(jīng)末梢在局部釋放出來，參與損傷局部的免疫、炎癥反應(yīng)及損傷的修復(fù)。 L5～S2脊髓段神經(jīng)膠質(zhì)細

4、胞參與前列腺疼痛調(diào)節(jié)的可能機制研究中，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究尤其重要。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)屬于哺乳動物應(yīng)激與炎癥激活的絲裂原活化蛋白激酶家族重要成員。p38MAPK信號通路參與了細胞的生長發(fā)育及細胞間功能同步等多種生理過程，并與炎癥、應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控密切相關(guān)，被認為是細胞信息傳遞的交匯點和共同通路。脊髓cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP respo

5、nseelement binding protein，CREB)轉(zhuǎn)錄因子屬于堿性氨基酸亮氨酸拉鏈(bZIP)轉(zhuǎn)錄因子家族，參與多種生物分子基因表達的調(diào)控。核轉(zhuǎn)錄因子kB(Nuclear factor-kappa b，NF-kB)是能調(diào)節(jié)多種炎癥和免疫基因表達的一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。有證據(jù)表明，這些因子在疼痛機制中發(fā)揮一定的作用，研究這些因子的生物學(xué)特性及其在慢性前列腺疼痛脊髓膠質(zhì)細胞活化中的調(diào)節(jié)機理，有助于進一步了解慢性前列腺疼痛的發(fā)

6、病機制，及促進抗慢性前列腺疼痛藥物的有效開發(fā)。 目的：1、觀察L5-S2脊髓段背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)和體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞活化中p38MAPK的變化，觀察炎性因子水平的變化及與p38MAPK的關(guān)系；2、探討CREB和NF-KB在p38MAPK所致脊髓星形膠質(zhì)細胞活化中的作用，明確脊髓星形膠質(zhì)細胞活化中p38MAPK細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及在大鼠慢性前列腺炎疼痛中的作用。 方法：

7、第一部分：p38MAPK在P物質(zhì)刺激脊髓星形膠質(zhì)細胞體外活化中的作用 分離培養(yǎng)SPF大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞，設(shè)正常對照組(正常組)、sP刺激組(SP組，10-7mol/L)、SB203580阻斷p38MAPK組(SB組，10μmol/L)和SP刺激+SB203580阻斷p38MAPK組(SP+SB組)。WB法、RT-PCR法、ELISA法檢測1h，3h，12h，24h和36h時p38MAPK、p-p38(磷酸化p38MAPK)含量

8、及GFAP mRNA、TNF-α、NO水平和NOS活性的變化。 第二部分：p38MAPK在慢性前列腺炎大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)星形膠質(zhì)細胞活化中的作用 制作大鼠慢性前列腺炎疼痛模型，觀察L5-S2脊髓段背根神經(jīng)節(jié)中p38MAPK和磷酸化p38MAPK含量變化，測定培養(yǎng)上清液TNF-α、NO、NOS含量，同時應(yīng)用p38MAPK抑制劑作用于動物模型(骶管內(nèi)注射模型)，觀察抑制劑SB203580對p38MAPK活化與痛性物質(zhì)表達的

9、影響及關(guān)系。 第三部分：CREB和NF-KB在p38MAPK所致脊髓星形膠質(zhì)細胞活化中的作用 觀察體外膠質(zhì)細胞在SP刺激后P-P38、P-CREB、NF-KBp65的變化及關(guān)系，觀察抑制劑SB203580(p38MAPK inhibitor)、PD98059(CREB inhibitor)和SN50(NF-KBinhibitor)對各信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白活化與痛性物質(zhì)表達的影響及關(guān)系。分離培養(yǎng)SPF大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞，設(shè)正

10、常組、SP刺激組(SP組，10-7mol/L)、SP刺激+SB203580(10μmol/L)阻斷p38MAPK組(SP+SB組)、SP刺激+PD98059(10μmol/L)阻斷CREB組(SP+PD組)、SP刺激+SN50(10μmol/L)阻斷NF-KB(SP+SN組)。WB法、免疫熒光法、ELISA法檢測12h和24h時p-p38、p-CREB、NF-KBp65水平及GFAP、TNF-α、IL-1β水平變化。 結(jié)果與結(jié)論

11、： 第一部分：脊髓星形膠質(zhì)細胞GFAP陽性表達率大于95％。SP組脊髓星形膠質(zhì)細胞總p38MAPK水平無顯著變化，1h后P-p38開始升高，3h后GFAP mRNA水平顯著增高，同時NO、NOS和TNF-α水平顯著增高。用SB203580阻斷p38MAPK通路后，SP+SB組較SP組P-p38、GFAP mRNA、NO、NOS、TNF-α水平顯著降低。SB組總p38MAPK、P-p38、GFAP mRNA、NO、NOS、TNF-

12、α水平無顯著變化。提示p38MAPK信號通路參與了體外培養(yǎng)脊髓星形膠質(zhì)細胞P物質(zhì)刺激活化過程，阻斷p38MAPK信號通路可有效降低脊髓星形膠質(zhì)細胞炎性因子水平。 第二部分：前列腺炎組大鼠L5～S2脊髓背角中p-p38、GFAP、TNF-α、NO水平和iNOS活性在5d和10d均明顯高于正常對照組并隨時間增高。鎮(zhèn)痛組大鼠L5～S2脊髓背角中P-p38、GFAP、TNF-α、NO水平和iNOS活性在5d和10d均低于前列腺炎組。提示

13、脊髓p38MAPK信號通路參與了大鼠前列腺炎發(fā)生后脊髓痛覺傳導(dǎo)及SB203580鎮(zhèn)痛機制，阻斷p38MAPK信號通路可有效降低脊髓炎性因子水平。 第三部分：SP組脊髓星形膠質(zhì)細胞P-p38、p-CREB、NF-KBp65顯著升高，GFAP水平顯著增高，同時TNF-α和IL-1β水平顯著增高。與SP組比較，用SB203580阻斷p38MAPK通路后，SP+SB組P-p38、P-CREB、NF-kBp65顯著降低，GFAP、TNF-

14、α和IL-1β水平顯著降低。用PD98059阻斷CREB通路后，SP+PD組p-p38、NF-kBp65無顯著變化，p-CREB顯著降低，GFAP水平降低，同時TNF-α和IL-1β水平降低。用SN50阻斷NF-kB通路后，SP+SN組p-p38、p-CREB無顯著變化，NF-kBp65顯著降低，GFAP水平降低，同時TNF-α和IL-1β水平降低。提示體外培養(yǎng)中，SP刺激后脊髓星形膠質(zhì)細胞顯著活化，p38MAPK活化后通過CREB及N