SP與脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的關(guān)系及在慢性前列腺炎疼痛中的作用探討.pdf

1、背景及目的：慢性前列腺炎疼痛是泌尿外科中青年男性極其常見的一種病癥。既往的研究主要集中于前列腺本身病因的探討，而缺乏對前列腺炎疼痛的傳導(dǎo)通路和神經(jīng)調(diào)控機(jī)制的研究。目前研究發(fā)現(xiàn)部分慢性前列腺炎疼痛呈現(xiàn)出兩個明顯的特點(diǎn)：一、疼痛的泛化，疼痛不僅限于前列腺所在部分，而是分布在與膀胱尿道神經(jīng)支配相關(guān)的骶神經(jīng)支配區(qū)，在沒有原發(fā)病變的其它部位可出現(xiàn)自發(fā)疼痛，并不同程度地存在著膀胱和尿道肌肉的功能障礙，表現(xiàn)出內(nèi)臟牽涉痛的特點(diǎn)；二、疼痛的持續(xù)，臨床上可

2、見有些前列腺炎疼痛在前列腺檢查完全正常后仍存在持續(xù)疼痛。所以各種臨床現(xiàn)象提示：慢性前列腺炎疼痛極可能是一種持續(xù)的神經(jīng)牽涉痛，其疼痛的發(fā)生估計(jì)與支配前列腺的L<,5>-S<,2>脊段的改變有關(guān)。 本室對慢性前列腺炎疼痛的系列研究(見宋波，周占松，陳勇等的工作)現(xiàn)已得到了如下結(jié)果：1．成功構(gòu)建了慢性前列腺炎疼痛的大鼠模型；2．進(jìn)一步證實(shí)慢性前列腺炎疼痛是中樞位于L<,5>-S<,2>脊段的神經(jīng)牽涉痛。但對于慢性前列腺炎疼痛L<,5>

3、-S<,2>脊段神經(jīng)調(diào)控機(jī)制的相應(yīng)變化仍不清楚。 目前研究證實(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞和SP(P Substallce，P物質(zhì))參與了多種慢性疼痛的發(fā)生，部分神經(jīng)軀體痛模型中已發(fā)現(xiàn)相應(yīng)脊段存在星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化和SP免疫活性的增強(qiáng)，但對于星形膠質(zhì)細(xì)胞和SP在慢性前列腺炎疼痛中的作用尚無相關(guān)研究，因此，進(jìn)一步研究SP與脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞在慢性前列腺炎疼痛L<,5>-S<,2>脊段中的改變及相互之間的關(guān)系，將對闡明部分慢性前列腺炎疼痛的發(fā)生機(jī)理

4、具有重要意義。 一、活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞參與多種慢性疼痛的調(diào)制。隨著對中樞神經(jīng)系統(tǒng)研究的深入，發(fā)現(xiàn)痛覺的傳導(dǎo)和調(diào)制不僅僅是神經(jīng)元的功能，星形膠質(zhì)細(xì)胞也通過和神經(jīng)細(xì)胞的相互作用參與了病理性疼痛的產(chǎn)生和維持。已有研究發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)病變中存在免疫和內(nèi)分泌方面的病理改變，不僅影響致痛遞質(zhì)谷氨酸的代謝，還可通過旁分泌和內(nèi)分泌等方式，產(chǎn)生多種致炎因子和趨化因子，如TNF，IL-1，IL-6等，和慢性疼痛的產(chǎn)生密切相關(guān)。 二、S

5、P是一種重要的致痛神經(jīng)遞質(zhì)和調(diào)質(zhì)。SP通過從初級傳入神經(jīng)釋放后作用于脊髓背角相應(yīng)的受體，向中樞傳遞傷害性刺激和痛覺，廣泛參與痛覺的傳導(dǎo)和調(diào)制，在多種慢性疼痛中表達(dá)升高。目前對于慢性前列腺炎疼痛大鼠L<,5>-S<,2>脊髓是否存在星形膠質(zhì)細(xì)胞活化和SP表達(dá)的具體變化，以及二者之間的相互關(guān)系尚不清楚，有待進(jìn)一步的研究。 本課題作為向該研究方向探索的一個分題，主要對慢性前列腺炎疼痛中L<,5>-S<,2>脊段的星形膠質(zhì)細(xì)胞活化參與疼

6、痛調(diào)制的細(xì)胞分子機(jī)制、信號通路以及其中SP的作用進(jìn)行研究，以期初步闡明慢性前列腺炎疼痛的部分神經(jīng)調(diào)控機(jī)制并為臨床上的相應(yīng)的治療提供新的參考思路。 方法： 1．第一部分觀察慢性前列腺炎疼痛是否存在L<,5>-S<,2>脊段SP合成、相應(yīng)受體表達(dá)及星形膠質(zhì)細(xì)胞活化和炎性因子分泌的變化，即通過制作大鼠慢性前列腺炎疼痛模型，分別應(yīng)用FQ-RT PCR(實(shí)時熒光定量RT PCR)和Western-blot檢測L<,5>-S<,2>

7、脊段DRG(dorsal rootganglion，背根神經(jīng)節(jié))傳入神經(jīng)細(xì)胞SP合成和脊髓后角NK-1R(SP受體)、GFAP(glialfibrillary acidic protein，膠質(zhì)纖維酸性蛋白)、iNOS和TNF-α表達(dá)的變化。 2．第二部分在體外觀察SP是否促使脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、分泌炎性因子及影響谷氨酸代謝，即通過體外培養(yǎng)大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞，采用不同濃度的SP在一定時間刺激培養(yǎng)的細(xì)胞，利用ELISA法，硝酸

8、還原酶和比色法檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β、TNF-α、NO分泌和NOS表達(dá)的變化，<'3>H-Glu摻入法檢測谷氨酸的摻入；RT-PCR法檢測GFAP和GLT-1(glutamate transporter-1，谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1)的表達(dá)。 3．第三部分對SP激活脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行初探，即利用一定濃度的SP在不同時間刺激培養(yǎng)的細(xì)胞，通過Western-blot檢測P38MAPK的磷酸化變化和RT-PCR法檢測C-f

9、os的改變，及SB203580阻斷P38MAPK信號通路后上述炎性因子分泌的變化。 結(jié)果： 1．大鼠前列腺注射CFA的慢性前列腺炎疼痛模型中，L<,5>-S<,2>脊髓DRG神經(jīng)元中的SP合成和脊髓背角NK-1R的表達(dá)在6d和12d均明顯高于對照組(P<0.01)，12d和6d組明顯高于0d組(P<0.01)。 2．慢性前列腺炎疼痛大鼠中L<,5>-S<,2>脊髓背角中GFAP、TNF-α、iNOS表達(dá)在6d和1

10、2d均明顯高于各自正常對照組和0d組(P<0.01)，GFAP 12d組高于6d組(P<0.05)，iNOS的表達(dá)高峰在6d組(P<0.01)。 3．成功分離、培養(yǎng)和純化大鼠的脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞，并用GFAP鑒定純度達(dá)95％以上。 4．SP在10<'-9>-10<'-6>mol/L濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴性促進(jìn)脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β、NO和NOS，各濃度組與對照組相比差異顯著(P<0.01，P<0.05)，

11、但在10<'-6>mol/L SP作用組，IL-1β的分泌下降且與正常對照組沒有明顯差異(P>0.05)。 5．在SP(10<'-7>mol/L)的作用下，脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)GFAP的表達(dá)在0-72h逐漸升高，與正常對照組相比差異非常顯著(P<0.01)。 6．脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞在SP的刺激下，<'3>H-Glu的攝取逐漸下降，10<'-9>mol/l組與正常對照組有顯著差異(P<0.05)，10<'-8>-10<'-6

12、>mol/L SP作用下，脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞<'3>H-Glu攝取與正常對照組有非常顯著差異(P<0.01)。 7．脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1的表達(dá)在10<'-9>-10<'-8>mol/L SP作用組和正常對照組沒有顯著差異(P>0.05)，10<'-7>-10<'-6>mol/L SP刺激組GLT-1表達(dá)值低于正常對照組(P<0.05，P<0.01)。 8．SP(10<'-7>mol/L)刺激使P38MAKP明顯磷酸化

13、活化，其光密度值在15、30、45、60min均明顯高于對照組(P<0.05，P<0.01)，表達(dá)高峰在45min。 9．SP(10<'-7>mol/L)作用使C-fos明顯表達(dá)，在30min、1h、3h、6h均明顯高于對照組(P<0.05，P<0.01)，在3h達(dá)到高峰。 10．SP(10<'-7>mol/L)刺激脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯分泌炎性因子IL-1β、TNF-α和NO(P<0.01)，SB203580阻斷P38M

14、AKP信號通路后TNF-α和NO的分泌明顯下降(P<0.01)，IL-1β的分泌在阻斷前后沒有顯著差異(P>0.05)，單純SB203580阻斷組和正常對照組間均無明顯差異(P>0.05)。 結(jié)論： 1．成功制作了慢性前列腺炎疼痛大鼠模型，并觀察到L<,5>-S<,2>脊段存在致痛神經(jīng)遞質(zhì)SP作用的增強(qiáng)。 2．慢性前列腺炎疼痛可以引起L<,5>-S<,2>脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP表達(dá)增加，炎性因子TNF

15、-α和iNOS表達(dá)升高，表明慢性前列腺炎疼痛可以導(dǎo)致L<,5>-S<,2>脊髓中樞繼發(fā)的星形膠質(zhì)細(xì)胞活化及炎性改變，可能與慢性前列腺炎疼痛的持續(xù)和泛化有密切關(guān)系。 3．SP刺激下的脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP、TNF-α，IL-1β、NO、NOS合成增加，表明脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞活化與SP誘導(dǎo)有明顯關(guān)系。結(jié)合動物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證明：慢性前列腺炎疼痛中SP誘導(dǎo)下脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞活化和炎性因子分泌可以導(dǎo)致L<,5>-S<,2>脊段神經(jīng)炎性痛反應(yīng)